专利名称：一种体外高效提高蓝藻藻胆体向光系统ii传能的sgb缓冲液的制作方法
技术领域：
本发明属于藻类生物技术领域，涉及ー种体外高效提高蓝藻藻胆体向光系统II反应中心传能的SGB缓冲液。
背景技术：
蓝藻是一类能进行光合放氧的原核生物，也是研究光合作用的模式生物之一。电子显微镜的观察结果显示在蓝藻细胞类囊体膜上排列着数量众多的小颗粒——藻胆体， 其主要功能是捕获光能。因此，藻胆体是蓝藻细胞吸收光能，并传递至光系统反应中心的主要入口。正常条件下，蓝藻藻胆体与光系统II连结，把吸收的光能传递到光系统II反应中心。由于藻胆体具有亲水的属性，因此在分离藻胆体-光系统II超分子复合体时常常导致藻胆体从光系统II反应中心表面上脱落下来；即使部分保留的藻胆体-光系统II超分子复合体，也几乎失去了能量传递(从藻胆体向光系统II)的生物学功能。尽管人们能够单独地在体外分离出完整的藻胆体(中国专利CN1654629A—种完整藻胆体的制备方法)和光系统II复合体，然而至今尚未见有分离出完整的、且具备高效能量传递功能的藻胆体-光系统II超分子复合体。众所周知，合适的缓冲液是体外有效分离功能蛋白复合体所必须。目前，常规用于分离藻胆体-光系统II超分子复合体的缓冲液是SPC (Sucrose/phosphate/citrate) 但遗憾的是该缓冲液分离出的藻胆体_光系统II超分子复合体不具备高效传递光能的属性。因此，为了分离出具有高效传能的藻胆体-光系统II超分子复合体，必须开发出适宜分离该超分子复合体的新型缓冲液。
发明内容
本发明的目的在于提出ー种体外高效提高蓝藻藻胆体向光系统II传能的SGB缓冲液，这ー缓冲液的应用不仅能增加藻胆体与光系统II间的连接数量，而且能大大改善体外藻胆体向光系统II反应中心的传能效率。本发明采取的技术方案如下—种体外高效提高蓝藻藻胆体向光系统II传能的SGB缓冲液，包括以下组分O. 6-0. 9M蔗糖，O. 4-0. 6M磷酸盐，O. 2-0. 4M柠檬酸盐和O. 5-1. 2M甜菜碱，优选O. 8M蔗糖，O. 5M磷酸盐，O. 3M柠檬酸盐和IM甜菜碱。所述磷酸盐为磷酸ニ氢钾、磷酸ニ氢钠、磷酸氢ニ钾和磷酸氢ニ钠中的一种或两种以上的混合物。所述柠檬酸盐为柠檬酸三钠和柠檬酸三钾中的ー种或两种的混合物。柠檬酸盐有利于藻胆体向光系统II复合体的能量传递。进ー步，可用碱将上述SGB缓冲液pH调节至7.0，所述碱优选NaOH。这样可以更好地維持体外藻胆体和光系统II等功能复合体的稳定性。本发明还提供ー种蓝藻藻胆体-光系统II的超分子复合体的制备方法，包括以下步骤(I)将收集的蓝藻细胞重悬于上述SGB缓冲液中进行破碎，破碎时间为100-500S，每次10-20s，间隔5min ；(2)在4°C、18，OOOXg条件下离心60min，获得藻胆体和类囊体膜的混合物；(3)用去垢剂对藻胆体和类囊体膜的混合物进行增溶，然后用蔗糖密度梯度离心，从而获得藻胆体-光系统II的超分子复合体。所述去垢剂为体积百分比浓度为1%的Triton X-100。所述破碎和增溶在冰浴((TC )条件下进行。本发明的SGB缓冲液与常规SPC缓冲液相比，不仅能増加藻胆体与光系统11间的连接数量，而且能大大改善体外藻胆体向光系统II的能量传递效率。因此，本发明将有助 于人们从生物化学、生物物理学和结构生物学等水平上研究藻胆体和光系统II间的相互关系，从而大幅度提高藻类光合效率和生物量，为藻类能源化利用提供理论基础。
图I是本发明实施例I和实施例2中所得藻胆体-光系统II超分子复合体的低温荧光发射光谱。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进ー步说明，其目的在于更好地理解本发明的研究内容而非限制本发明的保护范围实施例I(I)将5g收集的蓝藻细胞(A73tl=L 0-1. 2)分别重悬于15mLSPC、SGB缓冲液中，用Bead-beater (Biospec,日本)在冰浴中进行破碎，破碎时间为100s,姆次IOs,间隔5min ；SPC缓冲液含有O. 5M蔗糖，O. 5M磷酸盐和O. 3M柠檬酸盐，而SGB缓冲液含有O. 8M蔗糖，O. 5M磷酸盐，O. 3M柠檬酸盐和IM甜菜碱，pH为7. O。(2)在4° C、18，OOOXg条件下离心60min，获得藻胆体和类囊体膜的混合物；(3)用lmLl% (V/V)去垢剂Triton X-100对藻胆体和类囊体膜的混合物进行增溶(冰浴中孵育lOmin)，然后用蔗糖密度梯度离心(4° C、150，000Xg条件下离心17h ;CP100WX,日立，日本)，从而获得藻胆体-光系统II的超分子复合体，用蛋白免疫印迹和低温(77K)荧光(F4500，日立，日本)等方法分别检测所获得的藻胆体-光系统II的超分子复合体的数量和能量传递效率。检测结果与常规SPC缓冲液相比，本发明SGB缓冲液増加了约2. I倍藻胆体-光系统II超分子复合体的数量(从该超分子复合体的条带强度和蛋白免疫印迹的条带密度进行判断，下同)。图I中，曲线I为本实施例中用SPC缓冲液获得的藻胆体-光系统II超分子复合体的77K低温荧光发射光谱，曲线2为本实施例中用SGB缓冲液获得的藻胆体-光系统II超分子复合体的77K低温荧光发射光谱。可以看出，与常规SPC缓冲液相比，本发明SGB缓冲液提高了约2. 3倍蓝藻藻胆体向光系统II的能量传递效率。
实施例2步骤(I)与实施例I的不同之处在于破碎时间为500s,姆次20s,间_ 5min ;步骤(2)和(3)与实施例I相同。检测结果常规SPC缓冲液分离出藻胆体-光系统II超分子复合体的数量不到实施例I的三分之一，而本发明SGB缓冲液分尚出藻胆体_光系统II超分子复合体的数量与实施例I类似。
曲线4为本实施例中用SPC缓冲液获得的藻胆体-光系统II超分子复合体的77K低温荧光发射光谱，可以看出，其能量传递效率不到实施例I中用SPC缓冲液获得的藻胆体-光系统II超分子复合体的三分之一；曲线3为本实施例中用SGB缓冲液获得的藻胆体-光系统II超分子复合体的77K低温荧光发射光谱，其能量传递效率仅略低于与实施例I中用SGB缓冲液获得的藻胆体-光系统II超分子复合体的能连传递效率。以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例和附图所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
权利要求
1.ー种体外高效提高蓝藻藻胆体向光系统II传能的SGB缓冲液，包括以下组分.O. 6-0. 9M蔗糖，O. 4-0. 6M磷酸盐，O. 2-0. 4M柠檬酸盐和O. 5-1. 2M甜菜碱。
2.权利要求I所述的体外高效提高蓝藻藻胆体向光系统II传能的SGB缓冲液，其特征在于，包括以下组分0. 8M蔗糖，O. 5M磷酸盐，O. 3M柠檬酸盐和IM甜菜碱。
3.权利要求I或2所述的体外高效提高蓝藻藻胆体向光系统II传能的SGB缓冲液，其特征在于，所述磷酸盐为磷酸ニ氢钾、磷酸ニ氢钠、磷酸氢ニ钾和磷酸氢ニ钠中的一种或两种以上的混合物。
4.权利要求I或2所述的体外高效提高蓝藻藻胆体向光系统II传能的SGB缓冲液，其特征在于，所述柠檬酸盐为柠檬酸三钠和柠檬酸三钾中的ー种或两种的混合物。
5.权利要求I或2所述的体外高效提高蓝藻藻胆体向光系统II传能的SGB缓冲液，其特征在于，用碱将所述SGB缓冲液pH调节至7. O。
6.权利要求5所述的体外高效提高蓝藻藻胆体向光系统II传能的SGB缓冲液，其特征在于，所述碱为NaOH。
7.—种蓝藻藻胆体-光系统II的超分子复合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)将收集的蓝藻细胞重悬于权利要求1-4任意一项所述的SGB缓冲液中进行破碎,破碎时间为100-500s，每次10-20s,间隔5min ； (2)在4°C、18，OOOXg条件下离心60min，获得藻胆体和类囊体膜的混合物； (3)用去垢剂对藻胆体和类囊体膜的混合物进行增溶，然后用蔗糖密度梯度离心，从而获得藻胆体-光系统II的超分子复合体。
8.权利要求7所述的蓝藻藻胆体光系统II的超分子复合体的制备方法，其特征在干，所述去垢剂体积百分比浓度为1%的Triton X-100。
9.权利要求7所述的蓝藻藻胆体光系统II的超分子复合体的制备方法，其特征在干，所述破碎和增溶在冰浴条件下进行。
全文摘要
本发明公开了一种体外高效提高蓝藻藻胆体向光系统II传能的SGB缓冲液，由以下组分组成0.6-0.9M蔗糖，0.4-0.6M磷酸盐，0.2-0.4M柠檬酸盐和0.5-1.2M甜菜碱。与常规SPC缓冲液相比，本发明SGB缓冲液不仅增加了藻胆体与光系统II间的连接数量，而且大大改善了体外藻胆体向光系统II反应中心的传能效率；本发明将有助于人们从生物化学、生物物理学和结构生物学等水平上研究藻胆体和光系统II间的相互关系，从而大幅度提高藻类光合效率和生物量，为藻类能源化利用提供理论基础。
文档编号C12N1/06GK102660463SQ201210142640
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月9日 优先权日2012年5月9日
发明者王全喜, 陈李萍, 马为民, 马宇恒, 高复旦, 魏兰珍 申请人:上海师范大学