专利名称：提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法。
背景技术：
氮素是自然界中动物、植物、微生物中不可缺少的生命元素，在活细胞内，氮是所有氨基酸、核酸及其他许多重要分子的主要组成部分。大气中的氮，必须通过以生物固氮为主的固氮作用，才能被植物吸收利用，动物直接或间接地以植物为食物才能吸收利用氮素。生物固氮是指某些种类的固氮微生物利用体内的固氮酶在常温常压下将大气中的氮还原成氨的过程。根据固氮微生物的固氮特点以及与植物的关系，可以将生物固氮作用分为自生固氮、共生固氮和联合固氮三类。大豆根瘤菌是共生固氮微生物中的一类，与宿主植物形成共生固氮体系后进行生物固氮，为宿主植物提供生长所必需的氮元素。统计表明，在3种 固氮形式中，共生固氮效率最高，固氮量最多。长期以来，人们把豆科植物根瘤的固氮作用视为粮食生产的基础，它既可保持土壤肥力，又可提高粮食作物的产量。生物固氮仍然是生命科学研究中的重大课题，而且在农业生产中也具有重要的应用价值。生物固氮不仅固氮量大，而且还可以提高土壤肥力，改善土壤板结情况，减少化肥的使用量，不污染环境；更为重要的是它有取之不尽，用之不竭的廉价氮源，常温常压下可以固氮，成本低，利用率高，因此，生物固氮是今后肥料发展的主要方向之一。黑龙江省是我国大豆的主产区，年播种面积、总产量和出口量均居全国首位，加强生物固氮作用的研究及应用对提高我省大豆的产量有重要意义。目前,大豆根瘤菌基因工程菌株在接种到大豆幼苗后，与原始出发菌株相比，大豆植株所结根瘤数增加23. 73%，大豆产量增加3. 8% 51. 39%，增幅较小。
发明内容
本发明是要解决现有大豆根瘤菌基因工程菌株在接种到大豆幼苗后，与原始出发菌株相比，大豆植株所结根瘤数及大豆产量增幅小的问题，提供一种提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法。本发明提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、对费氏中华根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取费氏中华根瘤菌15067的基因组DNA;二、采用同源序列克隆法，以费氏中华根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得扩增产物，将扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒TaKaRa Agarose GeL DNA Purification Kit进行纯化，获得目的基因dctA ;三、对目的基因dctA进行测序鉴定；四、将目的基因dctA与重组质粒载体PET-Plae分别经NdeI和BamHI进行双酶切，将酶切后的目的基因dctA和酶切后的载体pET_Pla。连接，获得重组载体pET-Plae-dctA ;五、以重组载体pET-Plae-dctA为模板进行PCR扩增，构建Pla。-dctA_T7片段，然后将Pla。-dctA-17片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，将酶切后的Plac-dctA-I7片段和酶切后的pTR102质粒载体连接，构建原核生物表达载体pTR-Plae-dctA ；六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR-Plae-dctA转化到费氏中华根瘤菌15067中，即获得基因工程菌株HD-SF-04 ;其中步骤二中PCR扩增所用上游引物Pl为5' -CGCCATATGATGCGCGGATTACGAGTGC-3'，下游引物 P2 为 5' -GCGGGATCCTCACTCCGCTGACTTGGCAAAC-3';步骤五中PCR扩增所用上游引物P3为5' -CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3'，下游引物 P4 为 5' -CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA-3'。大量的研究结果已经表明，苹果酸、延胡索酸和琥珀酸等四碳二羧酸(dCAs)是植物体直接供给类菌体以支持其共生固氮所需要的碳源及能源。增强四碳二羧酸转移酶基因(dctABD)的表达可以增强宿主植物体的光合产物向类菌体的传递，从而以满足其氨类物质的同化吸收过程和固氮作用对碳源及能量的需求。四碳二羧酸转移酶基因dctABD是植物类菌体在共生固氮时所必需的基因，其结构基因dctA编码四碳二羧酸转移酶，并且受调控于调节基因dctB和dctD，其中dctA基因和dctB、dctD基因呈现出反向的排列结构。本发明获得的基因工程菌株HD-SF-04与出发菌株及含空载体pTR102的菌株相t匕，接种转基因工程菌株HD-SF-04的大豆植株所结根瘤的固氮酶活性增加约37%，大豆 植株所结根瘤数增加53. 73%，大豆产量上增加约62. 02%。本发明所构建的工程菌株HD-SF-04对黑龙江省大豆生产的实际需求有很大的现实意义。
图I为具体实施方式
一步骤一中PCR扩增获得的目的基因dctA电泳图；图2为具体实施方式
一步骤四中重组质粒载体PET-Pla。双酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳检测图；图3为具体实施方式
一基因工程菌株HD-SF-04的菌落发光性检测图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行一、对费氏中华根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取费氏中华根瘤菌15067的基因组DNA;二、采用同源序列克隆法，以费氏中华根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得扩增产物，将扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因dctA ;三、对目的基因dctA进行测序鉴定；四、将目的基因dctA与重组质粒载体PET-Plae分别经NdeI和BamHI进行双酶切，将酶切后的目的基因dctA和酶切后的载体PET-Plae连接，获得重组载体pET-Plae-dctA ;五、以重组载体pET-Plae-dctA为模板进行PCR扩增，构建Pla。-dctA-17片段，然后将Pla。-dctA-17片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，将酶切后的Pla。-dctA-17片段和酶切后的PTR102质粒载体连接，构建原核生物表达载体pTR-Plac;-dCtA ;六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR-Plae-dctA转化到费氏中华根瘤菌15067中，即获得基因工程菌株HD-SF-04 ;其中步骤二中 PCR 扩增所用上游引物 PI 为 5' -CGCCATATGATGCGCGGATTACGAGTGC-3'，下游引物 P2为 5 ' -GCGGGATCCTCACTCCGCTGACTTGGCAAAC-3 ';步骤五中 PCR 扩增所用上游引物 P3 为5' -CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3'，下游引物 P4 为 5' -CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA_31 o步骤一中费氏中华根瘤菌15067购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)菌种保藏编号是ACCC15067，在中国农业微生物菌种保藏管理中心仍处于可用状态。步骤二中所述胶回收试剂盒为购买自TaKaRa公司的琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(TaKaRa Agarose GeL DNA Purification Kit)。步骤四中重组质粒载体pET_Pla。的构建方法为采用聚合酶链式反应向Iac启动子片段两端各引入Bgl II和Nco I酶切位点，对Iac启动子的PCR产物与载体pET-28a(购买自Novagen公司)分别经BglII和Nco I进行双酶切后，回收所需目的片段，进行连接，构建质粒载体PET-Plac。步骤五中所述pTR102质粒载体由《高效固氮重组大豆根瘤菌株的构建及其根圈定殖微生态学研究》(李友国、周俊初，华中农业大学博士论文，2000年)的作者处得到。步骤一中的具体操作方法为将4°C保存的费氏中华根瘤菌15067三区划线接种到 YMA 固体培养基(每 IOOOmL 由 IOg 的甘露醇、0. 2g 的 KH2P04、0. 2g 的 MgSO4 7H20、0. 2g的NaCl、0. Ig的酵母膏、5g的CaCl2、18. 0 20. Og的琼脂粉和余量的蒸馏水组成)，放入恒温培养箱中，在28°C下培养72h ;挑取单菌落接种到YMA液体培养基(每IOOOmL由IOg的甘露醇、0. 2g 的 KH2P04、0. 2g 的 MgSO4 .7H20、0. 2g 的 NaCl,0. Ig 的酵母膏、5g 的 CaCl2 和余量的蒸馏水组成)，置于空气摇床上，在28°C，180r/min振荡培养72h进行菌株扩培，然后用CTAB法提取费氏中华根瘤菌15067的基因组DNA并用I %琼脂糖凝胶电泳检测。将纯化后的目的基因dctA与TA克隆载体pMD18-T (购买自TaKaRa公司)进行连接，连接方法参照TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒说明书，获得连接产物；采用CaCl2法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞；将连接产物和大肠杆菌DH5 a感受态细胞在无菌条件下混匀，采用热休克法即冰浴而后突然温浴的方式使其转化，加入SOC液体培养基(20g的蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaClUOmL的0. 25MKCl、5mL的2M MgCl2、20mL的IM葡萄糖加入蒸馏水并定容至IOOOmL)，37°C摇床180r/min振荡培养lh，将菌液按不同梯度的量涂布于含Amp、IPTG、X-Gal的LB平板上进行蓝白筛选；用无菌牙签挑取平板上白色菌落于ImLLB液体培养基中，置于摇床中37°C，180r/min过夜培养，然后以菌液为模板，进行阳性克隆子的PCR鉴定，反应结束后取5 PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测；将鉴定结果为阳性的菌液活化，送至测序公司进行测序。将测序结果进行生物信息学分析，利用NCBI网站中的BLASTn程序对测序获得目的基因dctA的核苷酸序列进行在线分析，获得目的基因dctA的序列与Sinorhizobium fredii (费氏中华根瘤菌)NGR234的dctA基因的序列相似性高达99%,与R. Ieguminosarum(豆科植物根瘤菌)的dctAl基因的序列相似性高达96%,该基因即为费氏中华根瘤菌15067中的dctA基因。dctA基因的碱基序列如SEQ ID NO 1所示。本实施方式步骤一中PCR扩增获得的目的基因dctA电泳图如图I所示，图I中M为DNA Marker (DL2000)，泳道1、2和3均为目±的基因dctA电泳条带。本实施方式步骤四中重组质粒载体PET-Pla。双酶切后经I %琼脂糖凝胶电泳检测图如图2所示，图2中Ml为DNA Marker (DL15000)，泳道2为双酶切后的重组质粒载体PET-Plac, M2 为 DNA Marker (DL2000)。本实施方式获得的基因工程菌株HD-SF-04与转化空载体的菌株(TC :将pTR102空载体转化费氏中华根瘤菌15067中)和原始出发菌株(费氏中华根瘤菌15067)进行对比。pTR102质粒载体中带有发光酶基因luxAB，与传统的检测技术相比，IuxAB基因标记技术具有灵敏、精确、操作简便等特点。含有IuxAB基因的标记微生物能在其体内产生发光酶，在还原型黄素单核苷酸(FMNH2)存在下，氧化底物葵醛并产生发光现象，此现象可通过X光片记录下来。根据标记微生物的发光现象，可以确定标记微生物的位置、数量等。将dctA基因连入PTR102后，重组质粒也带有发光酶基因，通过三亲本杂交后，重组质粒导入大豆根瘤菌中。因此，可以利用IuxAB基因标记技术可以追踪重组载体在受体菌株中的遗传稳定性。在培养好的单菌落平板盖上滴加癸醛溶液50mL，然后将平板倒置于暗室，再把胶片放置在平板上约lmin，然后放在显影液中显影至观察到黑斑显现(中间应移动胶片以使其与显影液充分均匀接触)，快速将胶片放入清水中，充分洗掉显影液，再放于定影液中定影IOmin,最后用清水冲洗30min,至此X光片就已制作完成；X光片的结果见图3,可知的本 实施方式中的基因工程菌株HD-SF-04构建成功。
对本实施方式制备的基因工程菌株HD-SF-04中原核生物表达载体pTR-Plae-dctA的遗传稳定性的测定，并将基因工程菌株HD-SF-04转到植物盆栽中做进一步的验证，具体步骤如下I、自生条件下遗传稳定性检测基因工程菌株HD-SF-04经纯化后，随机挑取5个单菌落，在YMA培养基(每IOOOmL由10. Og甘露醇、0. 2g磷酸氢二钾、0. 2g七水硫酸镁、0. 2g氯化钠、0. 4g酵母粉、5. Og碳酸钙和余量的蒸馏水组成)上连续转接10次，最后挑取数个单菌落分别点种在加抗生素的YMA培养基(每IOOmL YMA培养基加120 u L浓度为50mg/mL的氨苄抗生素)和YMA培养基上，28°C培养至长出菌落，检查菌落的发光性；2、共生条件下遗传稳定性检测将标记后的基因工程菌株HD-SF-04制成菌悬液，接种于大豆植株根部，并以费氏中华根瘤菌15067和不接菌作对照，光照培养至40d左右收获，将收获的根瘤切成两半，倒扣于培养皿底部，在培养皿中滴加50 ii L癸醛溶液，在暗室中即可观察到发光，显影并用X光片曝光记录，由此计算发光根瘤占所有根瘤的百分率；HD-SF-04，TC的重组质粒经连续转接后的保持率见表I所示；表I
权利要求
1.提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行 一、对费氏中华根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取费氏中华根瘤菌15067的基因组DNA ;二、采用同源序列克隆法，以费氏中华根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得扩增产物，将扩增产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因dctA ;三、对目的基因dctA进行测序鉴定；四、将目的基因dctA与重组质粒载体PET-Plae分别经NdeI和BamHI进行双酶切，将酶切后的目的基因dctA和酶切后的载体PET-Plae连接，获得重组载体pET-Plae-dctA ;五、以重组载体pET-Plae-dctA为模板进行PCR扩增，构建Pla。-dctA-17片段，然后将Pla。-dctA-17片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，将酶切后的Pla。-dctA-17片段和酶切后的PTR102质粒载体连接，构建原核生物表达载体pTR-Plac;-dCtA ;六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR-Plae-dctA转化到费氏中华根瘤菌15067中，即获得基因工程菌株HD-SF-04 ;其中步骤二中 PCR 扩增所用上游引物 PI 为 5' -CGCCATATGATGCGCGGATTACGAGTGC-3'，下游引物 P2为 5 ' -GCGGGATCCTCACTCCGCTGACTTGGCAAAC-3 ';步骤五中 PCR 扩增所用上游引物 P3 为5' -CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3'，下游引物 P4 为 5' -CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA_3' o
2.根据权利要求I所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中PCR扩增的反应体系如下 成分用量400ng/jiL费氏中华根瘤菌15067基因组DNA0 5^L 0.2(^M 引物 PlI.OpL 0.2(iM 引物 P21.0|iL \0^1-xTaq 缓冲液2.0|iL lOmmol/L dNTP1.5|iL Ex Taq DNA 聚合酶0.5|iL 无菌水13.5pL PCR扩增条件为94°C变性5min，94°C变性30s，54。。退火30s，72。。延伸90s，共35个循环，再72°C延伸7min,4°C保温。
3.根据权利要求I所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中目的基因dctA的双酶切反应体系如下成分用量目的基因次以IO.O|.iL 限制性内切酶AfefeI 1.0|iL 限制性内切酶Bamm 1.0|iL IOx T 缓冲液2.0|iLBSA (牛血清白蛋白)0.2|iL无菌水5.8|iL 酶切反应条件37°C水浴保温3小时。
4.根据权利要求I所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中重组质粒载体pET-Pla。的双酶切反应体系如下 成分用量重组质粒载体pET-PlaElO.OuL限制性内切酶MMI.OuL限制性内切酶BamHlI .OjaL IOx T 缓冲液2.0|iL BSA0.2|iL 无菌水5.8|iL 酶切反应条件37°C水浴保温3小时。
5.根据权利要求I所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤四中连接反应体系如下成分用量IOxT4 DNA连接酶缓冲液2.5|iL 酶切后的目的基因dctA10 0^l酶切后的重组质粒载体pET-Pla。2.0|iL T4DNA 连接酶1.0|iL无菌水9.5|iL 连接反应条件16 °C水浴保温过夜。
6.根据权利要求I所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤五中PCR扩增的反应体系如下成分用量400ng/VL iRflL获休 pET-Pl;k'-dctA0.5|iL 0.2^iM 引物 P31.0|iL0.2[iM 引物 P4I.OnL IQy-Ex Taq 缓冲液2.0|iL I Ommol/L dNTP1.5 (i L ￡x DNA 聚合酶0.5|xL 无菌水13.5|iL PCR扩增条件为94°C变性5min，94°C变性30s，65。。退火30s，72。。延伸90s，共35个循环，再72°C延伸7min,4°C保温。
7.根据权利要求I所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤五中Pla。-dctA-17片段单酶切反应体系如下成分用量Plac-dctA-T7 片段丨 O.OpL限制性内切酶KpnlLOnLIOx L 缓冲液2.0|iL 无菌水7.0|iL 酶切反应条件37°C水浴保温3小时。
8.根据权利要求I所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤五中pTR102质粒载体单酶切反应体系如下成分用量pTR102质粒载体丨0.0(iL限制性内切酶Kpnll.OuLIOx L缓冲液2.0叫 无菌水7.0(iL 酶切反应条件37°C水浴保温3小时。
9.根据权利要求I所述的提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤五中连接反应体系如下成分用量IOxT4 DNA连接酶缓冲液2.5吣酶切后WPlac-dctA-T7片段10.0叫酶切后的pTR102质粒载体2.0|iLT4DNA 连接酶1.0|iL 无菌水9.5|iL连接反应条件16 °C水浴保温过夜。
全文摘要
提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法，涉及一种提高大豆结瘤数量的基因工程菌株的构建方法。本发明是要解决现有大豆根瘤菌基因工程菌株在接种到大豆幼苗后，与原始出发菌株相比，大豆植株所结根瘤数及大豆产量增幅小的问题。方法对费氏中华根瘤菌进行活化和扩培，提取基因组DNA；采用同源序列克隆法，PCR扩增，获得目的基因dctA；对目的基因进行测序鉴定；构建重组载体pET-Plac-dctA；然后构建原核生物表达载体pTR-Plac-dctA；六、将原核生物表达载体转化到费氏中华根瘤菌中，即获得基因工程菌株。转化本发明基因工程菌株的大豆植株所结根瘤数增加53.73％，大豆产量增加62.02％。
文档编号C12N15/74GK102660573SQ201210148018
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者于冰, 吴川, 季琳, 宫世龙, 李海英, 李珊珊, 杨乐, 潘钰, 王琳琳, 蒙明明, 谷丹, 贾珊珊, 赵晨曦, 陈思学, 马春泉 申请人:黑龙江大学