专利名称：一种含ghrelin的羊胚胎体外培养液及其培养方法
技术领域：
本发明涉及ー种含ghrelin的羊胚胎体外培养液，以及利用该培养液进行羊胚胎体外培养的方法，属家畜胚胎工程技术领域。
(ニ)
背景技术：
随着现代繁殖生物技术的发展及胚胎体外生产技术的逐步完善，羊胚胎体外生产技术(体外受精或克隆)已成为加快品种选育和优良种群扩繁速度的重要途径。虽然通过胚胎体外生产技术已经获得了活的后代，但体外受精或克隆获得的体外胚胎在培养过程中普 遍存在发育阻断现象，即胚胎发育到一定阶段后停止发育并发生退化，导致体外胚胎的囊胚发育率远低于体内胚胎。此外，与体内胚胎相比，体外胚胎囊胚的细胞总数和内细胞团细胞数明显减少，体外胚胎移植入受体后，产仔率显著低于体内胚胎。目前的羊胚胎体外培养体系不能提供与体内早期胚胎相同或相近的营养环境是导致上述问题的关键原因之一，因此完善胚胎的早期培养体系、建立能提高囊胚发育率的体外培养液成为胚胎体外生产技术推广应用的ー个突破口。Ghrelin是1999年从小鼠的胃中提纯并鉴定的生长激素促分泌素受体的特定内源性配体。早期的研究表明，ghrelin的主要功能是通过激活磷酸脂酶C和蛋白激酶C信号通路，刺激垂体前叶释放生长激素，増加食欲、调节能量代谢平衡及促进胃酸的分泌。但随着研究的深入，越来越多的证据表明ghrelin在生殖调控方面发挥着重要作用。已在猪、羊和人的下丘脑和垂体中检测到ghrelin的表达。Ghrelin在大鼠卵巢整个发情周期内均表达，但在动情间期第I天的表达量最高，动情前期的表达量最低，这种周期性表达模式与黄体的功能相适应。而在整个妊娠期，妊娠早期卵巣ghrelin的表达量较高，怀孕后期表达量较低。研究还发现，ghrelin基因在非怀孕和蜕膜化的子宮内膜及胎盘中表达，在胚胎植入期间ghrelin作为子宫内膜基质细胞的蜕膜化的旁分泌调控子，暂时调控子宫内膜和胚胎之间的对话。Ghrelin基因在卵巣、子宫以及胎盘等生殖系统中的高效表达证实，其对体内胚胎的分化、发育和着床具有重要的调控作用。但到目前为止，尚未见有关ghrelin用于家畜繁殖技术领域，特别是用于胚胎体外培养的报道。
发明内容
本发明即是为了解决现有技术中羊胚胎体外培养液不能满足体外胚胎早期发育的需求，导致胚胎早期发育率较低的不足，提供了ー种具有提高体外胚胎早期发育率功能的含ghrelin的羊胚胎体外培养液及其培养方法。本发明采用的技术方案是ー种含ghrelin的羊胚胎体外培养液，所述羊胚胎体外培养液以TCM199培养液为基质，所述基质中还含有400 800ng/mL的ghrelin、0. 15mg/mL的谷氨酰胺、100IU/mL的青霉素、100 μ g/mL的链霉素和5 10mg/mL的牛血清白蛋白。
ghrelin是ー种多肽类生物活性因子，属于常用生化试剂，并已有商品出售。本发明中所用ghrelin由课题组从Sigma公司采购。TCM199培养液为本领域常规用于胚胎培养的培养液,可米用市购商品,本发明中所用TCM199培养液购自Sigma公司。优选的,所述羊胚胎体外培养液姆IOOOmL组成如下ghrelin 400 800mg,谷氨酰胺150mg，青霉素100000IU，链霉素100000 μ g，血清白蛋白5 10g，TCM199培养液补足至 1000mL。所述羊胚胎来自为绵羊或者山羊。优选的,所述羊胚胎体外培养液中，ghrelin含量为500 600ng/mL,牛血清白蛋白含量为8mg/mL。本发明还涉及应用所述羊胚胎体外培养液对羊胚胎进行体外培养的方法，所述方法是将受精后的早期羊胚胎用TCM199培养液反复冲洗后，放入所述含ghrelin的羊胚胎体外培养液中，于38 39°C、5% CO2的环境内，进行胚胎体外培养。所述早期羊胚胎由羊卵母细胞经体外成熟培养、体外受精获得。所述羊卵母细胞体外成熟培养方法如下从屠宰场获取的卵巣中用注射器抽取的羊卵母细胞，用成熟培养液在38 39°C、5% CO2的环境内培养20 24小吋，获得成熟的羊卵母细胞；所述成熟培养液以常规培养液为基质，所述基质中还含有10 μ g/mL的FSH (卵泡刺激素)、10 μ g/mL的LH(黄体生成素)、100IU/mL的青霉素、100 μ g/mL的链霉素和体积百分含量为8% 20%血清，所述常规培养液为TCM199、DMEM、F12、MEM培养液中的ー种或两种以上的混合物；所述的血清为小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清中ー种。所述羊卵母细胞体外受精方法如下将成熟的羊卵母细胞与精子一同放入受精培养液中，在38 39°C、5% CO2的环境内培养18 24小时，进行受精，获得早期羊胚胎；所述受精培养液为含2%羊血清的TCM199培养液。本发明胚胎体外培养液，是根据目前胚胎体外培养时囊胚率较低，不能满足在生产中推广应用的需要，结合ghrelin的生物学功能研制而成。ghrelin作为生长激素促分泌素受体的内源性配体，具有调控生殖激素分泌；促进卵泡生长、排卵；调节卵巢功能；參与胚胎早期发育调控等功能。因此ghrelin应用于羊胚胎体外培养，可以有效促进胚胎体外发育，解决了目前羊早期胚胎体外发育率低的问题。其经济成本较低，便于在生产中推广应用。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :制备含ghrelin的羊胚胎体外培养液准确称取ghrelin (Sigma公司)60 mg,先用20 mL的TCM199培养液溶解,然后向培养液中加入15mg谷氨酰胺、800 mg牛血清白蛋白和10000 IU的青霉素，10000 μ g的链霉素，轻微搅拌均匀，再加入TCM199培养液至IOOmL,再次搅拌混匀。用0. 22 μΜ的微滤 膜抽滤消毒后，在4°C下贮存，备用。实施例2 :含ghrelin的培养液用于山羊胚胎体外培养
山羊卵母细胞在含有10 μ g/ml的FSH、10 μ g/ml的LH、100IU/mL的青霉素、100 μ g/mL的链霉素和体积百分含量为10%血清的TCM199培养液中成熟培养，然后进行体外受精。受精后的早期胚胎分别在不含ghrelin的TCM199培养液(对照组)及实施例I制备的含ghrelin的羊胚胎体外培养液中继续培养7天。培养的第2天，对照组中的早期胚胎分裂率为64. 9%，在实施例I制备的含ghrelin的羊胚胎体外培养液中的早期胚胎分裂率为78. 3%，比对照组提高13. 4%。培养的第7天，对照组中的早期胚胎囊胚期发育率为24. 0%，在实施例I制备的含ghrelin的羊胚胎体外培养液中的早期胚胎囊胚期发育率为33. 7%，比对照组提高9. 7%。结果证实，含ghrelin的羊胚胎体外培养液体外培养山羊胚胎可有效提高受精后的早期胚胎发育率。实施例3 :含ghrelin的培养液用于绵羊胚胎体外培养绵羊卵母细胞在含有10 μ g/mL的FSH、10 μ g/mL的LH、lOOIU/mL的青霉素、100 μ g/mL的链霉素和体积百分含量为10%血清的TCM199培养液中成熟培养，然后进行体外受精。受精后的早期胚胎分别在不含ghrelin的TCM199培养液(对照组)及实施例I制备的含ghrelin的羊胚胎体外培养液中继续培养7天。培养的第2天，对照组中的早期胚胎分裂率为62. 7%，在实施例I制备的含ghrelin的羊胚胎体外培养液中的早期胚胎分裂率为76. 4%，比对照组提高13. 7%。培养的第7天，对照组中的早期胚胎囊胚期发育率为25. 3%，在实施例I制备的含ghrelin的羊胚胎体外培养液中的早期胚胎囊胚期发育率为35. 4%，比对照组提高10. 1%。结果证实，含ghrelin的羊胚胎体外培养液体外培养绵羊胚胎可有效提高受精后的早期胚胎发育率。权利要求
1.一种含ghrelin的羊胚胎体外培养液，其特征在于所述羊胚胎体外培养液以TCM199培养液为基质，所述基质中还含有400 800ng/mL的ghrelin、0. 15mg/mL的谷氨酰胺、100IU/mL的青霉素、100 μ g/mL的链霉素和5 10mg/mL的牛血清白蛋白。
2.如权利要求I所述的羊胚胎体外培养液，其特征在于所述羊胚胎体外培养液每IOOOmL组成如下ghrelin 400 800mg,谷氨酰胺150mg,青霉素100000IU,链霉素100000 μ g，血清白蛋白5 10g, TCM199培养液补足至IOOOmL0
3.如权利要求I或2所述的羊胚胎体外培养液，其特征在于所述羊胚胎体外培养液中，ghrelin含量为500 600ng/mL,牛血清白蛋白含量为8mg/mL。
4.应用如权利要求I或2所述羊胚胎体外培养液对羊胚胎进行体外培养的方法，所述方法是将受精后的早期羊胚胎用TCM199培养液反复冲洗后，放入所述含ghrelin的羊胚胎体外培养液中，于38 39°C、5% CO2的环境内，进行胚胎体外培养。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述早期羊胚胎由羊卵母细胞经体外成熟培养、体外受精获得。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述羊卵母细胞体外成熟培养方法如下从屠宰场获取的卵巢中用注射器抽取的羊卵母细胞，用成熟培养液在38 39°C、5% CO2的环境内培养20 24小时,获得成熟的羊卵母细胞；所述成熟培养液以常规培养液为基质，所述基质中还含有10 μ g/mL的FSH、10 μ g/mL的LH、100IU/mL的青霉素、100 μ g/mL的链霉素和体积百分含量为8% 20%血清，所述常规培养液为TCM199、DMEM、F12、MEM培养液中的一种或两种以上的混合物；所述的血清为小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清中一种。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述羊卵母细胞体外受精方法如下将成熟的羊卵母细胞与精子一同放入受精培养液中，在38 39°C、5% CO2的环境内培养18 24小时，进行受精，获得早期羊胚胎；所述受精培养液为含2%羊血清的TCM199培养液。
全文摘要
本发明提供了一种含ghrelin的羊胚胎体外培养液，所述羊胚胎体外培养液以TCM199培养液为基质，所述基质中还含有400～800ng/mL的ghrelin、0.15mg/mL的谷氨酰胺、100IU/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素和5～10mg/mL的牛血清白蛋白。本发明胚胎体外培养液中ghrelin 作为生长激素促分泌素受体的内源性配体，具有调控生殖激素分泌；促进卵泡生长、排卵；调节卵巢功能；参与胚胎早期发育调控等功能。因此ghrelin应用于羊胚胎体外培养，可以有效促进胚胎体外发育，解决了目前羊早期胚胎体外发育率低的问题。其经济成本较低，便于在生产中推广应用。
文档编号C12N5/073GK102676449SQ20121014857
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者俞颂东, 王争光, 白惠琴, 白骊骅 申请人:浙江大学