专利名称：鲍曼不动杆菌多重降落pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及鲍曼不动杆菌感染的分子诊断技术领域，具体涉及多重降落PCR检测方法在下呼吸道标本中鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)检测中的应用。
背景技术：
鲍曼不动杆菌为重要的院内感染病原，广泛存在于自然界中，生命力顽强。在医院环境中，鲍曼不动杆菌广泛存在于各种医疗器械与患者的被褥中，亦可于医护人员的手、工作服、听诊器中检出。近年来其在院内感染中的重要性不断上升，主要累及危重患者(如IUC患者)，可引起呼吸道感染、脓毒血症与泌尿系统感染等，是医院获得性肺炎(HAP)、尤其是呼吸机相关肺炎(VAP)的重要致病菌。
Neil Woodford 等(Woodford N，et al. Multiplex PCR for genes encodingprevalent OXAcarbapenemases in Acinetobacter spp. Int J AntimicrobAgents, 2006，27 (4) : 351353.)以bla0XA_51_like基因为靶标建立的PCR的检测结果支持bla^n&基因为鲍曼不动杆菌所固有。然而Lee Y T等发现I株不动杆菌基因型13TU临床分离株亦存在 blaQXA_5Hike 基因(Lee Y T, et al. First identification of bla0XA_51_likein non-baumannii Acinetobacter spp. J Chemother, 2009，21 (5) : 514520.)。同时针对鲍曼不动杆菌的多个基因进行检测可提高检测方法的特异性。Korbie，D.J.等(Korbie，D.J. and J. S. Mattick, Touchdown PCR. for increased specificity and sensitivity inPCR amplification. Nat. Protocols, 2008. 3 (9) :p. 1452-1456.)发现降落 PCR 可提高 PCR的特异性与灵敏度。当前尚无同时针对鲍曼不动杆菌gltA、gyrB、bla0XA_51_like基因以检测鲍曼不动杆菌的多重PCR报道。本发明建立的多重降落PCR可直接检测下呼吸道标本中的鲍曼不动杆菌，费时少，具高度特异性与灵敏性，有利于鲍曼不动杆菌感染的快速诊断与流行病学调查。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可快速特异检测下呼吸道标本中鲍曼不动杆菌的多重PCR检测试剂盒及检测方法。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术发案实现的一种鲍曼不动杆菌多重降落PCR检测试剂盒，包括10XPCR缓冲液，MgCl2, dNTP,TaqDNA聚合酶，BSA，鲍曼不动杆菌阳性对照DNA，3对鲍曼不动杆菌引物；所述3对鲍曼不动杆菌引物序列如下第I 对5 ’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3 ’ ( SEQ ID NO. I)与5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’ (SEQID NO. 2)；第2 对5，-TTATTATGACCGATGCCGATGT-3，( SEQ ID NO. 3)与5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’ (SEQID NO. 4)；第3 对5，-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3，( SEQ ID NO. 5)与5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’ (SEQID NO. 6) (Woodford N，et al.Multiplex PCRfor genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp.Int JAntimicrob Agents, 2006，27(4):351353.)；本发明还公开了应用上述试剂盒的检测方法(一)提取待检样本DNA(二)多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的gltA、gyrB、blaQXA_51_like基因，具
体步骤如下
反应体系25 nl
H2OI，V fd
缓冲液 110 X PCR)2.5
BSA(10 mg/ml)0.25 ^il
AB—glt.A-F (10 MmoI/L)0. 5 nl
AS—gltA-R (10 (Jfliol/L)0. 5 pi
AB—gyrB-F (10 Umol/L)I p.1
AB—gyrB-R (10 刚ol/L)Ipl
AB—0XA-F (10 rtiiol/L)I yd
AB—0XA-R (10 Wnol/L)Ipl
MgCl2 (25 niM)2 |il
dNTP (10 mM)0.5^1
Taq DNA 聚合j* (5 U/nl)0.2 ^il
DNA模板2 nl3对鲍曼不动杆菌引物为AB_gltA-F :5，-AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’(SEQ ID NO. I)AB_gltA-R :5，-AGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3，(SEQ ID NO. 2)AB_gyrB-F :5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’(SEQ ID NO. 3)AB_gyrB-R :5，-CAGAATGTGCTGCCATACCT-3，(SEQ ID NO. 4)AB_0XA-F :5’ -TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’ (SEQ ID NO. 5)AB_0XA-R :5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’ (SEQ ID NO. 6)(三)PCR反应循环参数如下94 °C 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循环降低 0. 5 °C ) 30s, 72 V lmin, 20 个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 个循环；72°C 7min。(四)电泳检测鉴定对多重降落PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有353bp、551bp、719bp条带中的任意2条或3条则代表检出鲍曼不动杆菌。有益效果本发明所建立的多重降落PCR可克服常规培养的耗时长、灵敏度低等问题，具有快速、简便、特异、灵敏度高等特征。可于当天出检测结果报告，可同时检测鲍曼不动杆菌的3个基因，对鲍曼不动杆菌DNA的检测下限达0. 82pg。该多重降落PCR可用于鲍曼不动杆菌感染的快速诊断与流行病学调查。
图I为建立的多重降落PCR的特异性检测结果；泳道I — 13模板依次对应为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、卡它莫拉菌(Moraxe Ila (Branhame 11a) catarrhal is )> 幾肠球菌(Enterococcus faecals)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、肺炎链 球菌(Streptococcu spneumoniae)、b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、牛分枝杆菌 BCG (Mycobacteriumbovis BCG);泳道14为DL2000DNA分子质量标准；泳道15-16模板依次为阳性对照鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)与阴性对照。图2为实施例I检测结果；泳道M为DL2000 DNA分子质量标准；泳道1_9模板为临床痰标本基因组DNA，泳道7、8于353bp、551bp、719bp处出现3条对应大小的条带，判为检出鲍曼不动杆菌，其相应标本的细菌培养结果亦证实检出鲍曼不动杆菌；泳道10、11为阳性对照与阴性对照。图3为建立的多重降落PCR的检测限检测结果泳道1-7模板依次对应为鲍曼不动杆菌基因组DNA82ng及其10 稀释模板；泳道8为阴性对照；泳道9为DL2000DNA分子质量标准；检出下限为5道模板,对应为8. 2pg鲍曼不动杆菌基因组DNA。
具体实施例方式实施例I :痰标本预处理痰标本应用生理盐水洗涤2次，加入等量的1%胰酶(当天现配现用)于37°C消化90min。提取痰标本中的细菌DNA :取已消化的痰标本I. 5ml用Takara minibest细菌基因组提取试剂盒(Takara，大连宝生)提取痰标本中的细菌DNA。提取的DNA直接用于PCR扩增或置于一 20°C保存备用。PCR扩增总体系25iU，在200iUPCR小管内依次加入12.55iU双蒸水，2.5iU缓冲液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 AB_gltA_F (10umol/L) 0. 5u I, AB_gltA_R(10umol/L)0. 5u l,AB_gyrB-F (10umol/L)lu l,AB_gyrB-R (10umo/L)lu 1，AB_0XA_F(10 u mol/L) I u I, AB_0XA-R (10 u mol/L) I u l,2u IMgCl2 (25mM) ,0. 5u I dNTP (IOmM)，0. 2u I Taq DNA聚合酶(5U/yl )，2 提取的痰标本基因组DNA。同时设鲍曼不动杆菌阳性模板对照与阴性对照(双蒸水作为模板)。手指轻弹混匀，短暂离心后放入PCR仪。3对鲍曼不动杆菌引物为针对鲍曼不动杆菌gltA基因的引物对AB_gltA_F:5’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’，AB_gltA-R :5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’，扩增片断长度 551bp ；针对鲍曼不动杆菌gyrB基因的引物对AB_gyrB_F:5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’，AB_gyrB-R :5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’，扩增片断长度 719bp ；针对鲍曼不动杆菌blaQXA_51_like基因的弓丨物对AB_0XA-F:5’ -TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’，AB_0XA_R :5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’，扩增片断长度353bp。设置PCR反应循环参数94 V 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循环降低0. 5°C ) 30s, 72°C lmin, 20 个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 个循环；72°C 7min。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，上样量为5 Ul与6X上样缓冲液混匀后加入胶孔中，于I X TAE溶液中，在100V电压下，电泳30min，电泳后经0. 5mg/L的溴化乙锭浸泡染色IOlOmin后，于凝胶成像分析系统中分析检测结果。如阴性对照无条带，阳性对照于353bp、551bp、719bp处出现对应大小的条带，检测样本出现353bp、551bp、719bp条带中的任意2条或3条则代表检出鲍曼不动杆菌(见图2);如阳性对照于353bp、551bp、719bp处未出现对应大小的条带或阴性对照出现非特异性条带，则判为实验失败，需重新检测。 实施例2:多重降落PCR的特异性检测。提取大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、卡它莫拉菌、粪肠球菌、流感嗜血杆菌、耻垢分枝杆菌、肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、鲍曼不动杆菌的基因组DNA，取上述细菌的纯培养物用Takaraminibest细菌基因组提取试剂盒(Takara，大连宝生)提取其基因组DNA。提取的DNA直接用于PCR扩增或置于_20°C保存备用。PCR扩增总体系25iU，在200iUPCR小管内依次加入12.55iU双蒸水，2.5iU缓冲液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 AB_gltA_F (10 u mol/L) 0. 5u I, AB_gltA_R(10umol/L)0. 5u l,AB_gyrB-F (10umol/L)lu l,AB_gyrB-R (10umol/L)lu 1，AB_0XA_F(10 u mol/L) Iii I, AB_0XA-R (IOu mol/L) I u l,2u IMgCl2 (25mM), 0. 5 u I dNTP (IOmM),0. 2 ill Taq DNA聚合酶(5U/ U I),模板为2 U I提取的细菌基因组DNA。同时设阴性对照(双蒸水作为模板)。手指轻弹混匀，短暂离心后放入PCR仪。3对鲍曼不动杆菌引物为针对鲍曼不动杆菌gltA基因的引物对AB_gltA_F:5’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’，AB_gltA-R :5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’，扩增片断长度 551bp ；针对鲍曼不动杆菌gyrB基因的引物对AB_gyrB_F 5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’，AB_gyrB-R :5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’，扩增片断长度 719bp ；针对鲍曼不动杆菌blaQXA_51_like基因的弓丨物对AB_0XA-F:5’ -TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’，AB_0XA_R :5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’，扩增片断长度353bp。设置PCR反应循环参数94 V 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循环降低0. 5°C ) 30s, 72°C lmin, 20 个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 个循环；72°C 7min。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，上样量为5 Ul与6X上样缓冲液混匀后加入胶孔中，于IXTAE溶液中，在100V电压下，电泳30min，电泳后经0. 5mg/L的溴化乙锭浸泡染色IOlOmin后，于凝胶成像分析系统中分析检测结果。鲍曼不动杆菌基因组模板于353bp、55Ibp、719bp处出现对应大小的条带，其它细菌基因组模板及阴性对照无条带出现(见图I)。实施例3:多重降落PCR的检测限确定。提取鲍曼不动杆菌 的基因组DNA :取鲍曼不动杆菌纯培养液I. 5ml用Takaraminibest细菌基因组提取试剂盒(Takara，大连宝生)提取其基因组DNA。提取的DNA直接用于PCR扩增或置于一 20°C保存备用。PCR扩增总体系25iU，在200iUPCR小管内依次加入12.55iU双蒸水，2.5iU缓冲液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 AB_gltA_F (10 u mol/L) 0. 5u I, AB_gltA_R(10umol/L)0. 5u l,AB_gyrB-F (10umol/L)l u l,AB_gyrB-R (10umol/L)lu 1，AB_0XA_F(10 u mol/L) I u I, AB_0XA-R (10 u mol/L) I u l,2u IMgCl2 (25mM) ,0. 5u I dNTP (IOmM)，0. 2u I Taq DNA聚合酶(5U/yl)，模板为2 yl提取的鲍曼不动杆菌基因组DNA或其10 稀释模板。同时设阴性对照(双蒸水作为模板)。手指轻弹混匀，短暂离心后放入PCR仪。3对鲍曼不动杆菌引物为针对鲍曼不动杆菌gltA基因的引物对AB_gltA_F:5’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’，AB_gltA-R :5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’，扩增片断长度 551bp ；针对鲍曼不动杆菌gyrB基因的引物对AB_gyrB_F 5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’，AB_gyrB-R :5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’，扩增片断长度 719bp ；针对鲍曼不动杆菌blaQXA_51_like基因的弓丨物对AB_0XA-F:5’ -TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’，AB_0XA_R :5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’，扩增片断长度353bp。设置PCR 反应循环参数94°C 5min ；94°C 30s, 65°C (每循环降低 0. 5°C ) 30s, 72°Clmin，20 个循环；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，20 个循环；72°C 7min。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，上样量为5 Ul与6X上样缓冲液混匀后加入胶孔中，于I X TAE溶液中，在100V电压下，电泳30min，电泳后经0. 5mg/L的溴化乙锭浸泡染色IOlOmin后，于凝胶成像分析系统中分析检测结果。将于353bp、551bp、719bp处出现对应大小条带的最低鲍曼不动杆菌基因组DNA浓度定义为该多重降落PCR的检测下限(见图3)。
权利要求
1. 一种鲍曼不动杆菌多重降落PCR检测试剂盒，包括=IOXPCR缓冲液，MgCl2, dNTP，Taq DNA聚合酶，BSA，鲍曼不动杆菌阳性对照DNA，3对鲍曼不动杆菌引物，其特征在于所述3对鲍曼不动杆菌引物序列如下第 I对5’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’ 与 5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’ ；第 2 对5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’ 与 5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’ ； 第 3 对5，-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3，与 5，-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3，。
全文摘要
本发明公开了一种可快速检测下呼吸道标本中鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)的多重降落PCR检测试剂盒。本发明属于下呼吸道感染性疾病的分子诊断技术领域，拟解决下呼吸道标本中鲍曼不动杆菌的快速诊断。所述试剂盒包括10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，TaqDNA聚合酶，BSA，鲍曼不动杆菌阳性对照DNA，以及3对鲍曼不动杆菌引物。本发明建立了可检测鲍曼不动杆菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法，采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。本发明建立的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法快速、简便、特异、灵敏，可用于鲍曼不动杆菌感染的快速诊断与流行病学调查。
文档编号C12R1/01GK102653793SQ201210148590
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者侯艳娇, 杜蓬, 潘红, 罗欲承, 邵世和, 钱静漪, 陈珵 申请人:江苏大学