专利名称：实时定量检测人类vstm1基因表达水平的引物及探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种实时定量检测人类VSTMl基因表达水平的引物及探针。
背景技术：
白血病是ー种造血干/祖细胞发生恶性病变的异质性造血系统肿瘤，以异常造血细胞的恶性増殖、分化受阻、凋亡受抑并造成正常造血干/祖细胞受抑为特征，是导致青少年死亡的最常见的恶性肿瘤，发病机制至今尚不明确。分子生物学的进展已证明基因异常是白血病形成的基础，2008年WHO发布的白血病和淋巴瘤诊断标准强调基因异常在血液恶性肿瘤诊断、分层及预后中的重要性。急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)相关的染色体易位造成的癌基因活化,如AMLl/ETO、PML/RARa、CBFb/MYHll等，已为人们所认知并在临床诊断、靶向治疗中发挥重要作用。但细胞癌基因的活化仅代表參与肿瘤发生的基因变化之一，另ー种变化是抑癌基因的失活。抑癌基因正常时起抑制细胞増殖和肿瘤发生的作用。许多肿瘤均发现抑癌基因的两个等位基因缺失或失活，失去细胞增生的阴性调节因素，导致肿瘤克隆的増殖和/或生存优势。目前存在的问题是，尚不能证明已发现的抑癌基因在AML发病机制中的普遍意义，而随着人类基因组计划顺利完成，有可能在大多数人类白血病中找到更多的诊断及药物作用靶点。虽然人类基因组全部序列已确定，但许多基因的功能仍然ー无所知。根据2010年发表的人类转录组数据库Η-Invitational Database (H-InvDB)的统计,在目前已注释的35，303个人类编码基因中，有功能报道的只有13，314个。因此，大量人类新发现的基因的功能、其在肿瘤病理机制中的作用及其开发应用仍有待于科学工作者的努力发掘。
发明内容
本发明的目的是提供一种实时定量检测人类VSTMl基因表达水平的引物及探针。本发明保护ー种试剂盒，包括特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列I所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。具体来说，所述探针甲的5’末端标记有荧光基团(如FAM荧光基团)，3’端标记有荧光淬灭基团(如BHQ荧光淬灭基团或TAMRA荧光淬灭基团)。所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(C)或(d): (a)辅助诊断肿瘤患者；(b)辅助评价肿瘤患者的疗效；(c)辅助鉴定肿瘤细胞系；(d)定量检测VSTMl基因的表达量。所述VSTMl基因可如序列表的序列7、序列表的序列9、序列表的序列10、序列表的序列11、序列表的序列12、序列表的序列13或GENBANK ACCESSION NO. NM_198481. 3所不。所述试剂盒还可包括阳性质粒；所述阳性质粒为含有VSTMl基因或其片段的重组质粒。所述阳性质粒具体可为含有序列7所示的VSTMl基因片段的重组质粒。所述阳性质粒更具体可为将PMD18-T载体与序列表的序列7所示的VSTMl基因片段连接得到的重组质粒。 所述(a)和/或所述(b)和/或所述(C)中，所述肿瘤为淋巴肿瘤或血液肿瘤。
所述(a)和/或(b)中，所述肿瘤患者具体可为血液肿瘤患者或淋巴肿瘤患者(淋巴瘤患者)，所述血液肿瘤患者更具体可为急性髓细胞白血病(AML)患者、急性淋巴细胞白血病(ALL)患者或慢性髓性白血病(CML)患者，所述急性髓细胞白血病(AML)患者具体可为M0/M1、M2、M3、M4、M5或M6亚型，所述初治慢性髓性白血病(CML)患者的亚型具体可为CML-慢性期患者或CML-加速/急变期患者。
所述(c)中，所述肿瘤细胞系具体可为淋巴肿瘤细胞系或血液肿瘤细胞系，所述淋巴肿瘤细胞系更具体可为Raji细胞，所述血液肿瘤细胞系具体可为K562细胞、MEG-Ol细胞、NB4细胞、HL60细胞、6T-CEM细胞、Jurkat细胞或KG-I细胞。本发明还保护特异性引物对甲和探针甲在制备试剂盒中的应用；所述特异性引物对甲为序列表的序列I所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。具体来说，所述探针甲的5’末端标记有荧光基团(如FAM荧光基团)，3’端标记有荧光淬灭基团(如BHQ荧光淬灭基团或TAMRA荧光淬灭基团)。所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(C)或(d): (a)辅助诊断肿瘤患者；(b)辅助评价肿瘤患者的疗效；(c)辅助鉴定肿瘤细胞系；(d)定量检测VSTMl基因的表达量。所述(a)和/或所述(b)和/或所述(C)中，所述肿瘤为淋巴肿瘤或血液肿瘤。所述(a)和/或(b)中，所述肿瘤患者具体可为血液肿瘤患者或淋巴肿瘤患者(淋巴瘤患者)，所述血液肿瘤患者更具体可为急性髓细胞白血病(AML)患者、急性淋巴细胞白血病(ALL)患者或慢性髓性白血病(CML)患者，所述急性髓细胞白血病(AML)患者具体可为M0/M1、M2、M3、M4、M5或M6亚型，所述初治慢性髓性白血病(CML)患者的亚型具体可为CML-慢性期患者或CML-加速/急变期患者。所述(c)中，所述肿瘤细胞系具体可为淋巴肿瘤细胞系或血液肿瘤细胞系，所述淋巴肿瘤细胞系更具体可为Raji细胞，所述血液肿瘤细胞系具体可为K562细胞、MEG-Ol细胞、NB4细胞、HL60细胞、6T-CEM细胞、Jurkat细胞或KG-I细胞。本发明还保护特异性引物对甲、探针甲和阳性质粒在制备试剂盒中的应用；所述特异性引物对甲为序列表的序列I所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述阳性质粒为含有VSTMl基因或其片段的重组质粒。具体来说，所述探针甲的5’末端标记有荧光基团(如FAM荧光基团)，3’端标记有荧光淬灭基团(如BHQ荧光淬灭基团或TAMRA荧光淬灭基团)。所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(C)或(d): (a)辅助诊断肿瘤患者；(b)辅助评价肿瘤患者的疗效；(c)辅助鉴定肿瘤细胞系；(d)定量检测VSTMl基因的表达量。所述阳性质粒具体可为含有序列7所示的VSTMl基因片段的重组质粒。所述阳性质粒更具体可为将PMD18-T载体与序列表的序列7所示的VSTMl基因片段连接得到的重组质粒。所述(a)和/或所述(b)和/或所述(C)中，所述肿瘤为淋巴肿瘤或血液肿瘤。所述(a)和/或(b)中，所述肿瘤患者具体可为血液肿瘤患者或淋巴肿瘤患者(淋巴瘤患者)，所述血液肿瘤患者更具体可为急性髓细胞白血病(AML)患者、急性淋巴细胞白血病(ALL)患者或慢性髓性白血病(CML)患者，所述急性髓细胞白血病(AML)患者具体可为M0/M1、M2、M3、M4、M5或M6亚型，所述初治慢性髓性白血病(CML)患者的亚型具体可为CML-慢性期患者或CML-加速/急变期患者。所述(c )中，所述肿瘤细胞系具体可为淋巴肿瘤细胞系或血液肿瘤细胞系，所述淋巴肿瘤细胞系更具体可为Raji细胞，所述血液肿瘤细胞系具体可为K562细胞、MEG-Ol细胞、NB4细胞、HL60细胞、6T-CEM细胞、Jurkat细胞或KG-I细胞。VSTMl (V-set and transmembrane domain containing I)基因在血液肿瘤的病理机制中可能发挥重要作用，该基因不仅参与正常造血细胞的发生、发展，而且可能与白血病细胞分化阻滞、异常增殖及不能适时凋亡有关，在髓系白血病病理机制中发挥重要作用。目前，国内外尚缺乏实时定量检测人类新基因VSTMl表达水平的引物对及探针。本发明提供的引物对和探针，可以用于定量检测VSTMl基因表达水平，从而用于 血液肿瘤细胞系的辅助鉴定或血液肿瘤患者(特别是白血病患者)的辅助诊断，将在医学检测领域发挥重要作用。
图I为内参对照质粒的RQ-PCR荧光标准曲线。图2为阳性对照质粒的RQ-PCR荧光标准曲线。图3为实施例5的结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。TRIzol kits :购自Invitrogen公司。RNAsin :购自华美生物技术公司。dNTP :购自Pharmecia公司。Mo-MLV逆转录酶、5X标准缓冲液购自Promega公司。DNA连接酶购自TakaRa公司。Universal PCR Master mix :购自天根生物技术有限公司。PhusionHigh-Fidelity PCR Kit :购自 New England Biolabs 公司。诊断标准依据FAB(French American British)分型标准[参照文献Bennett JM, Catovsky D,DanielMT, et al.Proposals for the classification ofthe acute leukaemias. French American British (FAB)co-operative group. Br JHaematol. 1976，33(4) :451-458.]。统计分析应用SPSS软件v. 13. 0。计量资料采用方差分析。p〈0. 05被认为是有统计学意义。实施例I、特异性引物对和探针的设计设计针对VSTMl基因(NCBI基因库序列号NM_198481. 3)的特异性引物对甲(由上游引物VSTMl-FP和下游引物VSTMl-RP组成，革巴序列为137bp)和探针甲(探针VSTMl-probe)上游引物VSTMl-FP (序列表的序列 I) :5’ -GCCGAGGCAGATTTATCCAA-3’ ；下游引物VSTMl-RP (序列表的序列 2) :5’ -CCTGGGTGGTGTCTGAAGCT-3’ ；探针VSTMl-probe (5，— 3，)FAM-CTCGACGGCAGACCCCCAAGG-BHQ (核苷酸序列为序列表的序列 3)。
设计针对ABLl基因(内参基因；NCBI基因库序列号NM_005157)设计的特异性引物对乙(由上游弓I物ABLl-F和下游弓I物ABLl-R组成，靶序列为124bp )和探针乙(探针ABLl-T-probe)上游引物ABLl-F (序列表的序列 4) :5’ -TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’
下游引物ABLl -R (序列表的序列 5) :5’ -GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’ ；探针ABLl-T-probe (5，—3，):FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA (核苷酸序列为序列表的序列 6)。分别合成特异性引物对甲、探针甲、特异性引物对乙和探针乙。可参考文献合成GabertJ, Beillard E, van der Velden VH, etal.Standardization and quality control studies of'real-time'quantitativereverse transcriptase polymerase chain reaction of fus ion gene transcriptsfor residual disease detection in leukemia —a Europe Against Cancer program.Leukemia. 2003，17:2318-57.。VSTMl基因目前发现五个剪切体,依次为vl至v5,vl和v2是最主要的形式，vl至v5的序列依次如序列表的序列9、序列表的序列10、序列表的序列11、序列表的序列12和序列表的序列13所示。本发明的提供的特异性引物对甲和探针甲针对五个剪切体的共同区域，即该5个剪切体均可检测到。实施例2、相关质粒的制备一、阳性对照质粒(含有VSTMl基因片段的质粒)的制备以VSTMl基因表达阳性的正常人(志愿者)的骨髓单个核细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增所用的引物对如下上游引物5’-GTGAGAAGGAAACTGCAAGAGTGGG-3’ ；下游引物5，-TTGATATGGACGAAGAGCAAGGAAA-3，。测序结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列7所示(993bp)。将所述PCR扩增产物插入PMD18-T质粒(pMD18_T载体系统，上海皓嘉公司，产品目录号D101A)，得到阳性对照质粒(骨架质粒为pMD18-T质粒，在ECOR V位点插入序列7所示的VSTMl基因片段)。二、内参对照质粒(含有ABL基因片段的质粒)的制备以正常人(志愿者)的骨髓单个核细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩
增产物。PCR扩增所用的引物对如下上游引物5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’ ；下游引物5’ -GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3 ’。测序结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列8所示(124bp)。将所述PCR扩增产物插入pMD18-T质粒(pMD18_T载体系统，上海皓嘉公司，产品目录号D101A)，得到内参对照质粒(骨架质粒为pMD18-T质粒，在ECOR V位点插入序列8所示的ABL基因片段)。
实施例3、检测阳性对照质粒的灵敏度检测将实施例2得到的阳性对照质粒用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释，得到各个稀释液(每微升分别含有10' IO6, ΙΟ5、104、IO3, IO2UO1UO0个拷贝的VSTMl基因片段)；将实施例2得到的内参对照质粒用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释，得到各个稀释液(每微升分别含有ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、103、IO2UO1UO0个拷贝的ABL基因片段);通过测定吸光度值计算VSTMl基因片段或ABL基因片段的拷贝数。将各个阳性对照质粒稀释液采用实施例I得到的特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。将各个内参对照质粒采用实施例I得到的特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。PCR反应体系(10 μ I):上游引物O. 4 μ M，下游引物O. 4 μ M，探针O. 25 μ M，2XTaqMan通用PCR公共体系5 μ I (ABI公司，美国)，质粒I μ I ;其余为去离子水。PCR 反应条件50°C 2min, I 个循环；95°C IOmin, I 个循环；95°C 15s,60°C lmin, 50个循环。内参对照质粒RQ-PCR荧光标准曲线见图I (阈值为O. 082)，函数为Iog10ABLl= (Ct-38. 47) /-3. 22，相关系数均达到O. 99以上，检测内参基因的灵敏度达10个拷贝。阳性对照质粒的RQ-PCR荧光标准曲线见图2 (阈值为O. 082)，函数为Iog10VSTMl= (Ct-39. 03)/-3. 51，相关系数均达到O. 99以上，检测VSTMl基因片段的灵敏度可达10个拷贝。实施例4、检测细胞系及白血病患者实施例4中所用的各个细胞系如下K562细胞购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHul91 ；MEG-01细胞购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHul97 Jurkat细胞购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu123 ;HL60细胞购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu23 ;6T-CEM细胞购自中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu2 ;KG_1细胞购自中国科学院昆明细胞库，产品目录号为KCB 200552YJ ；NB4细胞购自北京欣兴唐生物科技有限公司，产品目录号为CL007 ；Raji细胞购自北京欣兴唐生物科技有限公司，产品目录号为CL009 ;单个核细胞I :某个健康人(志愿者)的骨髓单个核细胞；单个核细胞2 :另一个健康人(志愿者)的骨髓单个核细胞。一、试剂盒的组装试剂盒由如下组件组成实施例I制备的针对VSTMl基因的特异性引物对甲和探针甲、针对ABLl基因的特异性引物对乙和探针乙；实施例2制备的阳性对照质粒和内参对照质粒。二、应用步骤一的试剂盒检测细胞系分别检测各个细胞系中的VSTMl基因的表达水平。每个细胞系样本皆重复检测3次。步骤如下I、提取各个细胞的总RNA，反转录为cDNA。2、以cDNA为模板，用特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量PCR仪(美国ABI 公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR ；以cDNA为模板，用特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR结果时阈值均固定为O. 082。PCR反应体系和PCR反应条件同实施例3。分别用阳性对照质粒和内参对照质粒制作标准曲线。对照标准曲线得到各细胞系中VSTMl基因和ABLl基因的拷贝数。以VSTMl基因的拷贝数与ABLl基因的拷贝数的比值表示VSTMl基因的相对表达水平(％)。结果见表I。表I在血液肿瘤细胞系中VSTMl基因的相对表达水平(均值土标准差)
权利要求
1.ー种试剂盒，包括特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列I所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d) : Ca)辅助诊断肿瘤患者；(b)辅助评价肿瘤患者的疗效；(c)辅助鉴定肿瘤细胞系；(d)定量检测VSTMl基因的表达量。
3.如权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括阳性质粒；所述阳性质粒为含有VSTMl基因或其片段的重组质粒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述阳性质粒为含有序列7所示的VSTMl基因片段的重组质粒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述阳性质粒为将PMD18-T载体与序列表的序列7所示的VSTMl基因片段连接得到的重组质粒。
6.如权利要求I至5中任一所述的试剂盒，其特征在于所述(a)和/或所述(b)和/或所述(C)中，所述肿瘤为淋巴肿瘤或血液肿瘤。
7.特异性引物对甲和探针甲在制备试剂盒中的应用；所述特异性引物对甲为序列表的序列I所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
8.特异性引物对甲、探针甲和阳性质粒在制备试剂盒中的应用；所述特异性引物对甲为序列表的序列I所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述阳性质粒为含有VSTMl基因或其片段的重组质粒。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(C)或(d) : Ca)辅助诊断肿瘤患者；(b)辅助评价肿瘤患者的疗效；(C)辅助鉴定肿瘤细胞系；(d)定量检测VSTMl基因的表达量。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述(a)和/或所述(b)和/或所述(C)中，所述肿瘤为淋巴肿瘤或血液肿瘤。
全文摘要
本发明公开了一种实时定量检测人类VSTM1基因表达水平的引物及探针。本发明提供了一种试剂盒，包括特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)(a)辅助诊断肿瘤患者；(b)辅助评价肿瘤患者的疗效；(c)辅助鉴定肿瘤细胞系；(d)定量检测VSTM1基因的表达量。本发明提供的引物对和探针，可以用于定量检测VSTM1基因表达水平，从而用于血液肿瘤细胞系的辅助鉴定或血液肿瘤患者(特别是白血病患者)的辅助诊断，将在医学检测领域发挥重要作用。
文档编号C12N15/11GK102649979SQ201210151188
公开日2012年8月29日 申请日期2012年5月15日 优先权日2012年5月15日
发明者冷馨, 李金兰, 谢敏, 阮国瑞, 陈珊珊, 韩文玲, 马大龙, 黄晓军 申请人:北京大学人民医院