专利名称：Sod基因修饰间充质干细胞的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于干细胞技术领域，尤其涉及一种SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法及其应用。
背景技术：
急性辐射综合症(ARS)发生在临床肿瘤患者的放疗及核恐怖、核事故中，人体中细胞更新快、代谢迅速的组织对辐射尤为敏感，如造血组织、肠道组织等。在经历2010年日本福岛核泄漏事件后，各国均开始对核安全问题重新重视起来。寻找更有效的治疗和预防ARS的治疗手段，是关系到国家安全、国民健康的重要任务。对于ARS的治疗，常规使用一些支持疗法，包括输血、补液、电解质、抗生素以及抗病毒药物，但治疗效果并不明显。当 前，国内外均未开发出有效的预防和治疗ARS的药物。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, S0D)是一种广泛存在于生物体内，能清除生物体内的超氧阴离子自由基，维持机体中自由基产生和清除动态平衡的一种金属酶。具有保护生物体，延缓衰老和治疗疾病等作用。由于受到半衰期短，相对分子量大，不易透过细胞膜，口服时易被胃蛋白酶分解等因素的限制，外源SOD很难作为药用酶广泛应用于临床中。因此，针对SOD的转基因治疗逐渐成为研究热点。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是骨髓基质中的主要干细胞,是成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种骨髓基质细胞的前体细胞。体外扩增的间充质干细胞(MSC)植入体内后可长期存活，仍保持其多向分化潜能，并且在损伤环境中还可以被诱导扩增，参与组织修复或再生反应。当前，针对MSC基因修饰的实验研究才刚刚兴起，国内外尚无基因转染MSC治疗ARS的相关报道。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，发明人出乎预料地发现，将S0D3基因连接到腺病毒载体中并感染间充质干细胞，得到的EC-SOD过表达间充质干细胞对辐射小鼠治疗效果良好，可延长辐射小鼠的存活期，从而完成本发明。本发明提供一种SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法，包括如下步骤
A)将S0D3基因连接到腺病毒载体上，得到重组腺病毒载体；
B)培养293细胞系，利用Lipofectamine转染试剂将重组腺病毒载体与包装质粒共转染到293细胞系中，常规培养10 12天，至293细胞系完全出现病变效应，收集得到腺病毒毒株，保存毒株并确认S0D3基因已成功连接到腺病毒载体上；
C)将腺病毒毒株进行大量扩增，感染293细胞系，经观察细胞出毒后收集腺病毒病毒液，对其进行超滤纯化浓缩，测定上清液中腺病毒的滴度；
D)腺病毒病毒液(S0D3-腺病毒)分别以不同条件感染间充质干细胞，确定感染的最佳条件，得到SOD基因修饰间充质干细胞。采用上述技术方案，本发明方法可得到EC-SOD基因的过表达的SOD基因修饰间充质干细胞，其胞内SOD蛋白含量增多，细胞培养液中的SOD相对活性明显增强；将SOD基因修饰间充质干细胞应用于辐射小鼠的治疗，可取得良好的治疗效果，可延长辐射小鼠的存活期。作为本发明的进一步改进，所述腺病毒载体采用穿梭质粒pDC315。作为本发明的进一步改进,所述包装质粒采用pBHGloxAEl和3Cre质粒载体。作为本发明的进一步改进，所述感染的最佳条件为50M0I病毒液结合5 μ M HP4短肽。本发明还提供所述SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法构建的SOD基因修饰间充质干细胞在制备治疗急性辐射综合症的药物中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果是采用本发明提供的构建方法，可得到 EC-SOD过表达的SOD基因修饰间充质干细胞，其胞内SOD蛋白含量增多，细胞培养液中的SOD相对活性明显增强；将SOD基因修饰间充质干细胞应用于辐射小鼠的治疗，可取得良好的治疗效果，可延长辐射小鼠的存活期，在制备治疗急性辐射综合症的药物方面具有广阔的应用前景。
图I为GFP标记的不同滴度腺病毒病毒液结合5 μ M ΗΡ4短肽感染MSC结果示意图。图2为MTT法测定50Μ0Ι腺病毒病毒液与5 μ M ΗΡ4多肽共同感染MSC48小时细胞存活率结果示意图。图3为流式细胞仪分别检测感染与未感染S0D3-腺病毒的MSC表面相关抗原结果示意图。图4为感染S0D3-腺病毒的MSC分化结果示意图。图5为MSC中EC-SOD过表达的鉴定结果示意图；其中，图5-Α为Western Blot检测MSC中EC-SOD蛋白含量结果示意图，图5-B为酶标法检测细胞培养液中SOD的相对活性结果示意图。图6为5. 5Gy射线辐射小鼠经不同种类的干细胞治疗效果示意图。图7为5. 8IGy射线辐射小鼠经不同种类的干细胞治疗效果示意图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明。实施例一 SOD基因修饰间充质干细胞的构建。腺病毒pDC315 载体、pBHGlox Δ El 和 3Cre 均购自 Microbix 公司。将S0D3基因连接到腺病毒PDC315载体上，得到腺病毒pDC315重组载体；培养293细胞系，利用Lipofectamine转染试剂将腺病毒pDC315重组载体与pBHGlox Λ El、3Cre质粒载体共转染到293细胞系中，常规培养11天，至293细胞系完全出现病变效应，收集得到腺病毒毒株，保存毒株，确认S0D3基因已成功连接到腺病毒载体上；将腺病毒毒株进行大量扩增，感染293细胞系，经观察细胞出毒后收集腺病毒上清液，对其进行超滤纯化浓缩，用TCID50 (半数组织培养感染剂量)的方法测定上清液中腺病毒的滴度；腺病毒病毒液(S0D3-腺病毒)分别以5、10、30、50、70、100 MOI的滴度梯度感染间充质干细胞，为提高干扰效率，在腺病毒病毒液感染的同时添加5 μ M的穿膜短肽ΗΡ4，结果如图I所示，确定50Μ0Ι为最佳感染滴度，得到SOD基因修饰间充质干细胞。如图2所示，50Μ0Ι腺病毒病毒液与5 μ MΗΡ4多肽共同感染MSC48小时，细胞存活率有一定程度的下降。流式细胞仪分别检测感染与未感染S0D3-腺病毒的MSC表面相关抗原结果，如图3所示，图3的结果说明了经S0D3-腺病毒感染后脐带间充质干细胞的特性无显著变化。感染S0D3-腺病毒的MSC分化结果如图4所示，可成功分化为脂肪细胞和成骨细胞。实施例二 MSC中EC-SOD过表达的鉴定。在得到合适的腺病毒感染条件后，获得过表达EC-SOD的MSC细胞株，经WesternBlot检测MSC胞内EC-SOD蛋白含量，结果如图5-A所示；酶标法测定细胞培养液中SOD相对活性，结果如图5-B所示。图5说明腺病毒携带的EC-SOD基因成功在MSC中表达，MSC胞内的EC-SOD蛋白含量增多，细胞培养液中SOD相对活性增强。实施例三SOD基因修饰间充质干细胞对辐射小鼠的治疗效果。本发明采用铯137伽玛射线照射小鼠为辐射损伤模型，每组10只小鼠，小鼠在
5.5Gy射线辐射后4小时，通过尾静脉输入SOD基因修饰间充质干细胞进行治疗，观察小鼠的存活情况，结果如图6所示。其中，UC :脐带间充质干细胞；UC+Null :空载腺病毒感染的脐带间充质干细胞；UC+S0D S0D3-腺病毒感染的脐带间充质干细胞；BM :骨髓来源的间充质干细胞，BM+Null :空载腺病毒感染的骨髓间充质干细胞；BM+ S0D3 :S0D3_腺病毒感染的骨髓间充质干细胞。S0D3基因修饰间充质干细胞注射量5X105，两次干细胞注射治疗，其注射间隔时间为72小时。其结果说明，在辐射后通过静脉输入间充质细胞(MSC)、经腺病毒空载体感染的MSC(MSC-Null)、或S0D3-腺病毒感染的MSC(MSC-SOD)对延长辐射小鼠存活期的有一定影响。在各种治疗处理中，MSC-SOD组显示出最好的治疗效果，受辐射小鼠的生存期提高44%。采用铯137伽玛射线照射小鼠为辐射损伤模型，每组10只小鼠，小鼠在5. SlGy射线辐射后3小时，通过静脉输入SOD基因修饰间充质干细胞治疗，观察小鼠的存活结果，结果如图7所示。其中，UC :脐带间充质干细胞；UC+Null :空载腺病毒感染的脐带间充质干细胞；UC+S0D3 S0D3-腺病毒感染的脐带间充质干细胞；UC+S0D3两次以UC+S0D3进行两次注射治疗；UC+S0D3三次以UC+S0D3进行三次注射治疗。S0D3基因修饰间充质干细胞注 射量为5X105，每次注射的间隔时间为72小时，结果表明干细胞治疗以2次效果最佳。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
权利要求
1.ー种SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法，其特征在于包括如下步骤 A)将S0D3基因连接到腺病毒载体上，得到重组腺病毒载体； B)培养293细胞系，利用Lipofectamine转染试剂将腺病毒重组载体与包装质粒共转染到293细胞系中，常规培养10 12天，至293细胞系完全出现病变效应，收集得到腺病毒毒株，保存毒株并确认S0D3基因已成功连接到腺病毒载体上； C)将腺病毒毒株进行大量扩增，感染293细胞系，经观察细胞出毒后收集腺病毒上清液，对其进行超滤纯化浓缩，測定上清液中腺病毒的滴度； D)腺病毒上清液分别以不同条件感染间充质干细胞，确定感染的最佳条件，得到SOD基因修饰间充质干细胞。
2.根据权利要求I所述的SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法，其特征在于所述腺病毒载体采用穿梭质粒PDC315。
3.根据权利要求2所述的SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法，其特征在于所述包装质粒采用pBHGloxAEl和3Cre质粒载体。
4.根据权利要求3所述的SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法，其特征在于所述感染的最佳条件为50M0I病毒液结合5 μ M HP4短肽。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法构建的SOD基因修饰间充质干细胞在制备治疗急性辐射综合症的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法，包括如下步骤A)将SOD3基因连接到腺病毒载体上，得到重组腺病毒载体；B)利用转染试剂将重组腺病毒载体与包装质粒共转染到293细胞系中，培养至293细胞系完全出现病变效应，收集得到腺病毒毒株，保存毒株并确认SOD3基因已连接到腺病毒载体上；C)将腺病毒毒株扩增，感染293细胞系，收集腺病毒上清液，超滤纯化浓缩后测定滴度；D)腺病毒病毒液分别以不同条件感染间充质干细胞，确定最佳的感染条件，得到SOD基因修饰间充质干细胞。本发明方法可得到EC-SOD基因过表达的SOD基因修饰间充质干细胞，将其应用于辐射小鼠的治疗，可延长辐射小鼠的存活期。
文档编号C12N15/861GK102660580SQ20121015516
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者丁长才, 刘宗才, 姜新根, 姜舒, 孟繁伟, 李婵, 李陶, 甘靖毅, 胡祥 申请人:深圳市北科生物科技有限公司