专利名称：一种用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物检测的培养基，尤其涉及一种用于分离和检测志贺氏菌的
显色培养基。
背景技术：
志贺氏菌属(Shigella)属于肠杆菌科,有四个种,分别为痢疾志贺氏菌gelladysenteriae)、福氏志贺氏菌{Shigellaflexneri)、鲍氏志贺氏菌{Shigellaboydii)、宋内志贺氏菌i^higellasomwr)。志贺氏菌属的四个种均能在人体中产生细菌性痢疾的溃疡性结肠感染，且是细菌性痢疾中最重要的病原菌。该病原菌一般通过排泄物污染的食物或 水传播的。每年世界各地均有大量因志贺氏菌感染而导致疾病的报道，我国受该菌的威胁也越来越大。因此，如何快速、准确、特异地从含有大量其它细菌的食品等样品中分离且鉴别出志贺氏菌具有重要的现实意义。目前对志贺氏菌的检测以选择性培养基为主，其原理是利用志贺氏菌不利用乳糖、蔗糖等糖类物质产酸的特性而与其它肠杆菌相区别。但是由于志贺氏菌的生物学特性与肠杆菌科其它细菌如大肠杆菌、沙门氏菌等非常相似，从而导致用于检测志贺氏菌的传统选择性培养基出现大量假阳性和假阴性结果。有的检测方法曾经建议同时使用三种不同的选择性培养基来检测单个样品，以增加培养基的准确性，这使得分离过程昂贵并且繁琐。虽然近年来已有一些基于分子生物学和免疫学的快速检测方法出现，但一方面，这些方法不能直接用于目标菌的检测，另一方面，这些方法需要专业的技术人员或者昂贵的仪器，使其应用受到了很大的限制。相比较，利用酶活性检测鉴别细菌是一种有效的方法，这种技术可以定量并初步鉴定目标菌，且操作简便，大幅度提高了工作效率。然而目前暂未发现志贺氏菌表达的特异性酶，使得志贺氏菌的显色培养基开发受到了限制。因此目前志贺氏菌显色培养基大多利用特异性酶使其它细菌显色，从而与不显色的志贺氏菌相区分。美国专利(Pat. No. 5，871，944)描述了一种从一个混合细菌样品中鉴别沙门氏菌和志贺氏菌的显色培养基，该培养基利用志贺氏菌不产P -半乳糖苷酶的特性，在培养基中添加相应的底物。然而，一方面，这种培养基不能区分沙门氏菌和志贺氏菌；另一方面，其它不产生￠-半乳糖苷酶的细菌将不能与志贺氏菌相区分，从而导致假阳性。虽然目前已有利用沙门氏菌产生硫化氢在培养基上显示黑心来区分沙门氏菌的志贺氏菌显色培养基，但是不产硫化氢的沙门氏菌仍然不能与志贺氏菌区分开，并且有些产硫化氢的沙门氏菌在培养基中产生黑心不明显，也会造成假阳性结果。综上所述，目前用于分离和检测志贺氏菌的培养基的技术瓶颈在于一方面，一种培养基很难同时检测志贺氏菌的四个种，造成漏检现象；另一方面，志贺氏菌与沙门氏菌等肠杆菌科细菌很难区分，造成假阳性结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基。
本发明所采取的技术方案为
一种用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉2 10 g、胰蛋白胨2 7 g、大豆蛋白胨2 10 g、氯化钠4 7 g、乳糖3 15g、鹿糖3 15 g、2-脱氧-D-核糖3 15 g、琼脂粉12 20 g、P -葡萄糖苷酶显色底物0. 05 0. 5 g、3 -卩比喃岩藻糖苷酶显色底物0. 05 0. 5 g、^ -半乳糖苷酶显色底物0. 05 0. 5 g、pH指示剂0. 03 0. 09 g、胆盐2 9 g、新生霉素钠I 5 mg、头孢磺啶I 10 mg、头孢克月亏0.01 0. I mg，余量为水。优选的，P -葡萄糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷。优选的，P -吡喃岩藻糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-P -吡喃岩藻糖苷。优选的，P -半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-P -半乳糖 苷。优选的，胆盐为去氧胆酸钠、猪胆盐、混合胆盐、牛胆盐和三号胆盐中的至少一种。优选的，胆盐为三号胆盐。优选的，pH指示剂为酚红。优选的,每1000 mL培养基中包含酵母粉4 g、胰蛋白胨3 g、大豆蛋白胨6 g、氯化钠5 g、乳糖5 g、蔗糖5 g、2-脱氧-D-核糖5 g、琼脂粉15 g、5_溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷0.4 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-吡喃岩藻糖苷0.2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-￠-半乳糖苷0.4 g、酹红0.08 g、三号胆盐6 g、新生霉素钠4 mg、头孢磺唳9 mg、头孢克肟0.03 mg，余量为水。本发明在培养基中添加了志贺氏菌不利用的碳水化合物以及指示剂酚红。志贺氏菌不利用的碳水化合物包括山梨醇、侧金盏花醇、2-脱氧-D-核糖、肌醇、木糖、纤维二糖、乳糖、卫矛醇、蔗糖、棉子糖、水杨素，能利用这些碳水化合物中的一种或几种产酸的细菌，在PH指示剂作用下显示的颜色，能将该细菌与志贺氏菌区分开来，本发明在优选pH指示剂酚红作用下使发酵糖类产酸的细菌显示出黄色菌落，从而与志贺氏菌区分。本发明优选乳糖、蔗糖和2-脱氧-D-核糖。本发明在培养基中添加了 ￠-葡萄糖苷酶、￠-吡喃岩藻糖苷酶和￠-半乳糖苷酶的显色底物，能表达产生这三种酶中的至少一种的细菌在酶的作用下分解底物，游离出发色基团，使菌落呈现出发色基团的色泽，从而与志贺氏菌相区分。本发明在培养基中添加了胆盐，可抑制样品中大部分的革兰氏阳性细菌。本发明的培养基还添加了抗生素。抗生素能抑制某些菌生长，如亚碲酸盐可用来延缓大肠埃希氏菌的生长，新生霉素钠和头孢克肟可以抑制变形杆菌的生长，头孢磺啶可以抑制假单胞菌属一类的细菌。本发明优选新生霉素钠、头孢磺啶和头孢克肟。细菌在本发明培养基中呈现的特征有
1)不利用乳糖、蔗糖和2-脱氧-D-核糖产酸并且不产P-葡萄糖苷酶、P -吡喃岩藻糖苷酶和3 -半乳糖苷酶的微生物会形成第一种颜色菌落(白色)，志贺氏菌呈现第一种颜色菌落；
2)能利用乳糖、蔗糖和2-脱氧-D-核糖中的至少一种物质产酸的微生物，在pH指示剂酚红作用下形成第二种颜色菌落(黄色);3)能产￠-葡萄糖苷酶、￠-吡喃岩藻糖苷酶和￠-半乳糖苷酶中至少一种的微生物，形成第三种颜色菌落(绿色);
4)能利用乳糖、蔗糖和2-脱氧-D-核糖中的至少一种物质产酸且产3-葡萄糖苷酶、^ -吡喃岩藻糖苷酶和3 -半乳糖苷酶中至少一种的微生物，则形成第二种和第三种颜色的混合颜色，从而形成第四种颜色的菌落(蓝绿色或墨绿色)；以上四种颜色容易区分。本发明的显色培养基用于分离和检测志贺氏菌的方法，包括如下步骤
1)显色平板的制备将上述显色培养基除新生霉素钠、头孢磺啶、头孢克肟、2-脱氧-D-核糖外的各组分，加入到去离子水中，搅拌，加热煮沸至完全溶解，调节pH至
6.8±0. 2，待冷却至45 55°C，加入过滤除菌的新生霉素钠、头孢磺啶、头孢克肟、2-脱氧_D_核糖,混勻,倒平板，备用；
2)样品处理依据各领域规范规定的样本处理方法处理；
3)接种培养将样品或含样品的增菌液划线或涂布接种到显色平板上，37°C培养20 24 h ;
4)结果分析若显色平板上培养基变红，出现清晰白色或无色半透明、直径为I 3_，没有色素沉着的菌落，则说明此菌落为可疑志贺氏菌菌落，可将该菌落挑出进一步做生化鉴定，其它细菌或被抑制或呈现黄色、绿色、蓝绿色、墨绿色。本发明的有益效果是
本发明的显色培养基可用于志贺氏菌属的四个种的分离和检测，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于各种样本的检测，有广泛的应用前景。显色培养基检测效果可达到进口 R&F公司同类产品水平，优于国内已有的同类产品。本发明的显色培养基大大降低了假阳性和假阴性结果的出现，有很广泛的应用前景。本发明的显色培养基适用于包含大量其它肠杆菌科的样品中志贺氏菌的分离和检测，特别地，本发明的培养基能很好地区分沙门氏菌和志贺氏菌。本发明的显色培养基比以往的培养基菌落颜色更少，更容易可靠地检测志贺氏菌，志贺氏菌在本发明培养基中呈现白色，可清晰地与其它细菌呈现的鲜艳黄色或绿色等颜色区分。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。实施例I
一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉4 g、胰蛋白胨3 g、大豆蛋白胨6 g、氯化钠5 g、乳糖5 g、鹿糖5 g、2-脱氧-D-核糖5 g、琼脂粉15g、5-溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷0. 4 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-P -吡喃岩藻糖苷0. 2g、5-溴-4-氯-3-卩引哚-N-乙酰-0 -半乳糖苷0. 4 g、酹红0.08 g、三号胆盐6 g、新生霉素钠4 mg、头孢磺啶9 mg、头孢克肟0.03 mg，余量为去离子水，pH为6. 8±0. 2。实施例2
一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉6 g、胰蛋白胨3 g、大豆蛋白胨7 g、氯化钠5 g、乳糖3 g、鹿糖8 g、2-脱氧-D-核糖7 g、琼脂粉18g、5-溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷0. 2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-P -吡喃岩藻糖苷0. Ig、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-￠-半乳糖苷0. 2 g、酚红0.06 g、三号胆盐5 g、新生霉素钠3 mg、头孢磺啶3 mg、头孢克肟0.05 mg，余量为去离子水，pH为6. 8±0. 2。实施例3
一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉8 g、胰蛋白胨2 g、大豆蛋白胨6 g、氯化钠5 g、乳糖5 g、鹿糖5 g、2-脱氧-D-核糖10 g、琼脂粉15 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-葡萄糖苷0. I g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-吡喃岩藻糖苷0.2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-￠-半乳糖苷0.4 g、酚红0.04 g、三号胆盐7 g、新生霉素钠2 mg、头孢磺啶8 mg、头孢克肟0. 07 mg，余量为去离子水，pH为6. 8±0. 2。实施例4
一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉7 g、胰蛋白胨6 g、大豆蛋白胨3 g、氯化钠5 g、乳糖8 g、鹿糖3 g、2-脱氧-D-核糖12 g、琼脂粉15 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-葡萄糖苷0.2 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-吡喃岩藻糖苷0.4 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-￠-半乳糖苷0. 3 g、酚红0.08 g、三号胆盐5 g、新生霉素钠3 mg、头孢磺啶7 mg、头孢克肟0.015 mg，余量为去离子水，pH为6. 8±0. 2。实施例5
一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉2 g、胰蛋白胨5 g、大豆蛋白胨4 g、氯化钠4 g、乳糖3 g、鹿糖9 g、2-脱氧-D-核糖15 g、琼脂粉17 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-葡萄糖苷0.3 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-吡喃岩藻糖苷0. 5 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-￠-半乳糖苷0.05 g、酚红0. 09 g、三号胆盐9 g、新生霉素钠I mg、头孢磺唳6 mg、头孢克月亏0.1 mg,余量为去离子水，pH为6. 8±0. 2。实施例6
一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉5 g、胰蛋白胨4 g、大豆蛋白胨10 g、氯化钠6 g、乳糖10 g、鹿糖15 g、2-脱氧-D-核糖8 g、琼脂粉12 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-葡萄糖苷0.5 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-￠-吡喃岩藻糖苷0.05 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-P-半乳糖苷0. I g、酚红0.03 g、三号胆盐4g、新生霉素钠5 mg、头孢磺唳10 mg、头孢克月亏0.01 mg,余量为去离子水,pH为6. 8±0. 2。实施例7
一种用于检测和分离志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉10 g、胰蛋白胨7 g、大豆蛋白胨2 g、氯化钠7 g、乳糖15 g、鹿糖3 g、2-脱氧-D-核糖3 g、琼脂粉20 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-P -葡萄糖苷0. 05 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-P -吡喃岩藻糖苷0. 3 g、5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-P -半乳糖苷0. 5 g、酚红0. 05 g、三号胆盐2g、新生霉素钠3 mg、头孢磺唳I mg、头孢克月亏0.05 mg,余量为去离子水，pH为6. 8±0. 2。特异性实验
将表I中所述22株标准菌株分别制成IO8 IO9 CFU/mL的菌悬液，分别取一环划线接种于实施案例I中所描述培养基制成的平板(简称HKM)上，37°C培养24 h，观察各菌的生长情况及菌落特征，结果见表2。注表2中菌落生长情况用生长几区来表示，4区表示生长良好，菌落大小正常，I 3区表示生长受抑制，菌落偏小或生长少于4区。
权利要求
1.一种用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基，每1000 mL培养基含有酵母粉2 10g、胰蛋白胨2 7 g、大豆蛋白胨2 10 g、氯化钠4 7 g、乳糖3 15 g、鹿糖3 15g、2_脱氧-D-核糖3 15 g、琼脂粉12 20 g、β -葡萄糖苷酶显色底物O. 05 O. 5 g、β -卩比喃岩藻糖苷酶显色底物O. 05 O. 5 g、β -半乳糖苷酶显色底物O. 05 O. 5 g、pH指示剂O. 03 O. 09 g、胆盐2 9 g、新生霉素钠I 5 mg、头孢磺啶I 10 mg、头孢克月亏O. 01 O. I mg，余量为水。
2.根据权利要求I所述的用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基，其特征在于β_葡 萄糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖苷。
3.根据权利要求I所述的用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基，其特征在于β_吡喃岩藻糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β -吡喃岩藻糖苷。
4.根据权利要求I所述的用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基，其特征在于β_半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰-β -半乳糖苷。
5.根据权利要求I所述的用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基，其特征在于胆盐为去氧胆酸钠、猪胆盐、混合胆盐、牛胆盐和三号胆盐中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基，其特征在于胆盐为三号胆盐。
7.根据权利要求I所述的用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基，其特征在于ρΗ指示剂为酚红。
全文摘要
本发明公开了一种用于分离和检测志贺氏菌的显色培养基，所述培养基含有酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、乳糖、蔗糖、2-脱氧-D-核糖、琼脂粉、β-葡萄糖苷酶显色底物、β-吡喃岩藻糖苷酶显色底物、β-半乳糖苷酶显色底物、酚红、三号胆盐、新生霉素钠、头孢磺啶、头孢克肟，余量为水。本发明的显色培养基可用于志贺氏菌属的四个种的分离和检测，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于各种样本的检测，有广泛的应用前景。显色培养基检测效果可达到进口R&F公司同类产品水平，优于国内已有的同类产品。
文档编号C12Q1/04GK102703565SQ20121015809
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者卢勉飞, 吴清平, 田亮, 蔡芷荷, 邱国建, 黄岭芳 申请人:广东环凯微生物科技有限公司