专利名称：一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法
技术领域：
本发明涉及溶菌酶制备技术领域，具体地说，涉及ー种溶菌酶的制备方法。
背景技术：
溶菌酶(Lysozyme),即N-こ酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase),是ー种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶(Muramidase)。它在生物体抵御外来微生物侵染方面发挥了关键作用，属于天然的抗菌、抗病毒活性物质，可作为天然的抗菌药和高安全性食品防腐剤，在食品、医疗卫生等行业具有极大的应用价值。溶菌酶广泛分布于各种生物组织及其分泌物中，其中鸡蛋蛋清中溶菌酶含量丰 富，约占O. 3% -O. 4%左右，同时鸡蛋清溶菌酶也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。因此，从蛋清中提取的鸡蛋溶菌酶是当前商品化溶菌酶的最主要来源。我国鲜蛋资源丰富，大型养鸡场的饲养规模一般在百万只以上，由于未进行深加エ，市场需求方式多为居民食用，很多养鸡场的实际饲养量与设计能力相差很大，造成了极大的资源及装备的浪费，甚至造成了蛋多伤农的现象。与此同时，随着现代エ业及人们需求的提高，又急需溶菌酶等蛋类的深加工品。据国际蛋业协会统计，国际市场上，欧美、东南亚、中东等国对溶菌酶需求量都很大，而且每年以10%的速率逐年递增，现在市场规模约为1000吨/年，而供需缺ロ达300吨/年。因此，开发鸡蛋溶菌酶的生产技术，是提高鸡蛋附加值、增加养殖企业收入的重要途径。传统溶菌酶的生产方法有结晶法、离子交换法、亲和层析法、色谱法等。结晶法是通过调整透析液的PH值，加入磷酸盐，再调整其PH值，然后离心去除杂质得到纯化液，再使溶菌酶以结晶态析出。离子交换法是溶菌酶生产最常用的方法，其原理是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离。亲和层析法是根据酶与作用底物的特异性亲和能力，利用酶分子独有的专ー性结合位点或结构性质的分离方法。如王峰在中国发明专利CN1464054中公开了ー种溶菌酶的提取方法，采用下述步骤获取蛋清，加入氯化钠溶液并搅拌；加入盐酸溶液，水域加温至40°C ；自然冷却至常温，加入こ酸溶液，水域加温至80°C ;离心后过滤，在滤清夜中加入氯化钠搅拌后再次加温至600C ;加入丙酮，滤取白色絮状物，自然干燥后，碾粉并包装。郭顺堂，杨砚等人在中国发明专利CN101619308中公开了ー种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法，包括如下步骤(A)在室温下，往蛋清中加入软化水，稀释；(B)进行均质；(C)均质后的溶液，调pH值；(D)离子交换树脂再生用氢氧化钠溶液，树脂与氢氧化钠溶液在搅拌罐里搅拌，用软化水洗；(E)将活化好的离子交换树脂与蛋清混合搅拌；(F)将搅拌罐的上清液倾出，滤干，用软化水清洗树脂中的杂蛋白；(G)将氯化钠溶液与清洗干净的树脂搅拌，洗脱吸附到离子交换树脂中的溶菌酶；(H)将搅拌罐中上清液倾出，滤干，用软化水清洗树脂中的残留溶菌酶；(J)超滤，浓缩，除盐；(K)将浓缩得到的溶菌酶通过干燥得到溶菌酶粉。
目前，传统的从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的制备技术普遍存在生产成本高、生产周期长、提取率和产品比活低、环境污染等缺点，产品质量难以满足下游各个领域的需求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的提供一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，以提高产品的酶活力、收率及纯度。为实现上述目的，本发明提供以下技术方案一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，包括如下步骤(I)提取液的配制 取去离子水，用乳酸调节PH值至2-5，然后加入氯化钠，制成氯化钠的质量百分含量为1-5%的提取液；(2)溶菌酶的选择性沉淀将步骤(I)所得提取液加热至60-90°C，然后边搅拌边加入蛋清液，用乳酸调节混合液的PH值< 4. 5，搅拌混合均匀后，保温静置，至出现明显的白色絮状沉淀；(3)分离纯化将步骤(2)所得混合液冷却至室温，然后离心分离，去除沉淀后，所得上清液即为溶菌酶粗酶液；(4)超滤脱盐将步骤(3)所得溶菌酶粗酶液用膜截留分子量为8，000-11, OOODa的中空纤维超滤膜装置进行超滤，滤液在室温下脱盐并浓缩得截留溶液；(5)干燥将步骤(4)所得截留溶液进行干燥，得到白色粉末状溶菌酶成品。优选地，所述步骤(I)中用乳酸调节去离子水的PH值为3-4。优选地，所述步骤(2)中蛋清液的加入量与提取液的重量比为I : 2-1 I。优选地，所述步骤(3)中的离心速度为1000-2000转/min，离心时间为2_10分钟。优选地，所述步骤(4)中超滤操作的压カ为O. 10-0. 50MPa。优选地，所述步骤(4)中的溶菌酶粗酶液在进行一次超滤后，可再进行二次超滤。优选地，所述二次超滤是以膜截留分子量为20，000-30, OOODa的中空纤维超滤膜装置，在O. 10-0. 50MPa的操作压カ下进行的。优选地，所述步骤(5)中的干燥方法为真空干燥或喷雾干燥。与现有技术相比，本发明具有如下优点和积极效果(I)在调节提取液的PH值时，本发明采用乳酸替代现有技术中普遍使用的盐酸或醋酸，由于乳酸具有很强的防腐保鲜功效，因此可提高产品的稳定性、安全性，同时使产品口味更加温和；(2)混合液在离心分离之前，先进行蛋清杂蛋白的等电点和温度选择性沉淀，采用选择沉淀法，利用溶菌酶等电点较高(Pl = 10. 7)的特性，通过降低体系的pH值，有利于杂蛋白的沉淀；其次，在酸性条件下，溶菌酶能长时间耐受高温而不失活，而其它蛋白质则不然，因此，等电点和温度结合选择沉淀法，可有效提高粗酶液中溶菌酶的含量；(3)本发明采用超滤膜技术，利用鸡蛋溶菌酶分子量为143000Da的特性，分别选择大、小两种孔径的中空纤维超滤膜，通过前后两次超滤分离，达到去除高分子杂蛋白和脱去小分子盐的目的，实现了溶菌酶的浓缩和精制纯化；(4)本发明综合了当前不同溶菌酶提取技术的优点和现代エ业化生产的特点，采用这种方法不仅可从鸡蛋蛋清中提取到较高产率和纯度的溶菌酶，而且提取后剰余的蛋清液中无有害物质残留，回收方便，还可用于蛋白片、蛋清粉等其它蛋制品的开发。本发明的终端产品溶菌酶在生物技术、医疗卫生及食品エ业等领域都有广泛的应用，具有重要的科学价值和经济效益。在医学领域，溶菌酶作为ー种具有杀菌作用的天然抗感染物质，有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用，临床上可用于治疗慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、帯状疱疹和扁平疣等，也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。在食品行业，溶菌酶可用作防腐剂，它的主要功能是水解细菌的细胞壁，在细胞内，则对吞噬后的病原菌起破坏作用，该酶对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有·分解作用；对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也具有一定程度的溶解作用。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步的说明，但本发明的内容并不局限于此。实施例I一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，包括如下步骤(I)提取液的配制 取IOOOg去离子水，用乳酸调节PH值至3，然后加入50g氯化钠，搅拌溶解，制成氯化钠的质量百分含量为5%的提取液；(2)溶菌酶的选择性沉淀将步骤(I)所得提取液进行蛋清杂蛋白的等电点和温度选择性沉淀，首先将提取液加热至90°C,然后边搅拌边加入IOOOg蛋清液,搅拌混合均勻，用乳酸控制混合液的pH值<4. 5，控制温度在80°C_85°C，即可出现明显的白色絮状沉淀，保温静置45分钟，使沉淀充分；(3)分离纯化将步骤(2)所得混合液冷却至室温，然后离心分离，离心速度为1000转/min，离心时间为10分钟，去除沉淀后，所得上清液即为溶菌酶粗酶液；(4)超滤脱盐将步骤(3)所得溶菌酶粗酶液用膜截留分子量为8，OOODa的中空纤维超滤膜装置进行超滤，超滤操作的压カ为O. lOMpa，将滤液再进行二次超滤，二次超滤使用的是膜截留分子量为30，OOODa的中空纤维超滤膜装置，操作压カ为O. 50Mpa，然后将滤液在室温下脱盐并浓缩得截留溶液；(5)干燥用真空干燥法将步骤(4)所得截留溶液进行干燥，得到白色粉末状溶菌酶成品。实施例2一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，包括如下步骤
(I)提取液的配制取IOOOg去离子水，用乳酸调节PH值至5，然后加入IOg氯化钠，搅拌溶解，制成氯化钠的质量百分含量为I %的提取液；(2)溶菌酶的选择性沉淀将步骤(I)所得提取液进行蛋清杂蛋白的等电点和温度选择性沉淀，首先将提取液加热至60°C,然后边搅拌边加入500g蛋清液,搅拌混合均勻，用乳酸控制混合液的pH值<4. 5，控制温度在60°C_65°C，即可出现明显的白色絮状沉淀，保温静置30分钟，使沉淀充分；(3)分离纯化
将步骤(2)所得混合液冷却至室温，然后离心分离，离心速度为2000转/min，离心时间为2分钟，去除沉淀后，所得上清液即为溶菌酶粗酶液；(4)超滤脱盐将步骤(3)所得溶菌酶粗酶液用膜截留分子量为11，OOODa的中空纤维超滤膜装置进行超滤，超滤操作的压カ为O. 50Mpa，将滤液再进行二次超滤，二次超滤使用的是膜截留分子量为20，OOODa的中空纤维超滤膜装置，操作压カ为O. lOMpa，然后将滤液在室温下脱盐并浓缩得截留溶液；(5)干燥用真空干燥法将步骤(4)所得截留溶液进行干燥，得到白色粉末状溶菌酶成品。实施例3一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，包括如下步骤(I)提取液的配制取IOOOg去离子水，用乳酸调节PH值至2，然后加入40g氯化钠，搅拌溶解，制成氯化钠的质量百分含量为4%的提取液；(2)溶菌酶的选择性沉淀将步骤(I)所得提取液进行蛋清杂蛋白的等电点和温度选择性沉淀，首先将提取液加热至80°C,然后边搅拌边加入750g蛋清液,搅拌混合均勻，用乳酸控制混合液的pH值<4. 5，控制温度在80°C_85°C，即可出现明显的白色絮状沉淀，保温静置15分钟，使沉淀充分；(3)分离纯化将步骤(2)所得混合液冷却至室温，然后离心分离，离心速度为1300转/min，离心时间为7分钟，去除沉淀后，所得上清液即为溶菌酶粗酶液；(4)超滤脱盐将步骤(3)所得溶菌酶粗酶液用膜截留分子量为10，OOODa的中空纤维超滤膜装置进行超滤，超滤操作的压カ为O. 30Mpa，然后将滤液在室温下脱盐并浓缩得截留溶液；(5)干燥用喷雾干燥法将步骤(4)所得截留溶液进行干燥，得到白色粉末状溶菌酶成品。实施例4—种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，包括如下步骤(I)提取液的配制
取IOOOg去离子水，用乳酸调节PH值至4，然后加入25g氯化钠，搅拌溶解，制成氯化钠的质量百分含量为2. 5%的提取液；(2)溶菌酶的选择性沉淀将步骤(I)所得提取液进行蛋清杂蛋白的等电点和温度选择性沉淀，首先将提取液加热至75°C,然后边搅拌边加入900g蛋清液,搅拌混合均勻，用乳酸控制混合液的pH值<4. 5，控制温度在75°C_80°C，即可出现明显的白色絮状沉淀，保温静置60分钟，使沉淀充分；(3)分离纯化将步骤(2)所得混合液冷却至室温，然后离心分离，离心速度为1600转/min，离心时间为4分钟，去除沉淀后，所得上清液即为溶菌酶粗酶液；(4)超滤脱盐
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将步骤(3)所得溶菌酶粗酶液用膜截留分子量为9，OOODa的中空纤维超滤膜装置进行超滤，超滤操作的压カ为O. 40Mpa，将滤液再进行二次超滤，二次超滤使用的是膜截留分子量为25，OOODa的中空纤维超滤膜装置，操作压カ为O. 30Mpa，然后将滤液在室温下脱盐并浓缩得截留溶液；(5)干燥用喷雾干燥法将步骤(4)所得截留溶液进行干燥，得到白色粉末状溶菌酶成品。根据实施例I所述制备方法连续进行3批次溶菌酶生产，并抽取该3批次产品样品进行化验分析，试验数据见表I。表I
权利要求
1.一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)提取液的配制 取去离子水，用乳酸调节PH值至2-5，然后加入氯化钠，制成氯化钠的质量百分含量为1-5%的提取液； (2)溶菌酶的选择性沉淀 将步骤(I)所得提取液加热至60-90°C，然后边搅拌边加入蛋清液，用乳酸调节混合液的PH值< 4. 5，搅拌混合均匀后，保温静置，至出现明显的白色絮状沉淀； (3)分离纯化 将步骤(2)所得混合液冷却至室温，然后离心分离，去除沉淀后，所得上清液即为溶菌酶粗酶液； (4)超滤脱盐 将步骤(3)所得溶菌酶粗酶液用膜截留分子量为8，000-11，OOODa的中空纤维超滤膜装置进行超滤，滤液在室温下脱盐并浓缩得截留溶液； (5)干燥 将步骤(4)所得截留溶液进行干燥，得到白色粉末状溶菌酶成品。
2.如权利要求I所述的一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中用乳酸调节去离子水的PH值为3-4。
3.如权利要求I所述的一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，其特征在于，所述步骤(2)中蛋清液的加入量与提取液的重量比为I: 2-1 I。
4.如权利要求I所述的一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的离心速度为1000-2000转/min，离心时间为2-10分钟。
5.如权利要求I所述的一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，其特征在于，所述步骤(4)中超滤操作的压力为0.10-0. 50MPa。
6.如权利要求I所述的一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的溶菌酶粗酶液在进行一次超滤后，可再进行二次超滤。
7.如权利要求6所述的一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，其特征在于，所述二次超滤是以膜截留分子量为20，000-30, OOODa的中空纤维超滤膜装置，在0. 10-0. 50MPa的操作压力下进行的。
8.如权利要求I所述的一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的干燥方法为真空干燥或喷雾干燥。
全文摘要
本发明涉及一种从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶的方法，包括如下步骤(1)提取液的配制；(2)溶菌酶的选择性沉淀；(3)分离纯化；(4)超滤脱盐；(5)干燥。本发明采用乳酸替代现有技术中普遍使用的盐酸或醋酸，由于乳酸具有很强的防腐保鲜功效，因此可提高产品的稳定性、安全性，同时使产品口味更加温和；此外，本发明分别选择大、小两种孔径的中空纤维超滤膜，通过前后两次超滤分离，达到去除高分子杂蛋白和脱去小分子盐的目的，使溶菌酶的纯度和收率得到进一步的提高。
文档编号C12N9/36GK102676475SQ20121016095
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者杨战勇, 闫路娜 申请人:石家庄华牧牧业有限责任公司