专利名称：一种高通量棉花品种dna指纹库构建方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法。
背景技术：
棉花是我国主要的经济作物，优良新品种的培育与推广对国民经济的发展与人民生活水平的提高具有重要意义。据统计，2000— 2009年我国通过国家及省级审定的棉花品种数量700多个。截止到2012年2月29日，已申请植物新品种保护的棉花品种达335个。然而，由于骨干亲本的集中使用与转基因技术在棉花育种中的大規模应用，棉花品种间的遗传差异越来越小，使得完全依赖传统的形态性状进行品种鉴别越来越困难。同时由于形态鉴定的时效性差，容易受到环境与主观因素的影响，品种多乱杂的现象难以得到有效控制。近年来，以微卫星(SSR)标记为基础的玉米、水稻等主要农作物的DNA指纹库构建已逐步开展，基于SSR标记在棉花遗传图谱构建、纯度鉴定与遗传多样性分析等方面的研究·也有相关报道。但常规聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染技术的检测方法在分析的材料和位点较多时，检测工作显得费时费力，且不同胶板间数据的整合与统计是ー项很繁琐的工作，数据结果的准确性也很难保证。多色荧光检测技术是以不同顔色的荧光染料标记在SSR引物的5’端，荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，并通过与各泳道的分子量内标进行比对，可自动读取产物片段大小，大大提高检测效率的同时保证了数据的准确性，尤其适用于大規模材料的检测分析。然而，基于棉花SSR的多色荧光标记检测技术构建我国棉花品种DNA指纹库的方法还未见相关报道。
发明内容
本发明目的是提供一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，以克服现有技术存在的上述不足。本发明提供的一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，包括以下步骤(I)提取棉花 DNA ；(2)使用分布于棉花全基因组26条染色体上的ー套40对核心引物分别对待测品种进行SSR-PCR检测，每对引物标记有荧光染料标记，所述核心引物的核苷酸序列如下表I所示表I
权利要求
1.一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，其特征在于，包括以下步骤 1)提取棉花DNA； 2)使用分布于棉花全基因组26条染色体上的ー套40对核心引物分別对待测品种进行SSR-PCR检测，每对引物标记有荧光染料，所述核心引物的核苷酸序列如下所示
2.根据权利要求I所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，步骤I)所述DNA提取包括以下步骤将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分后，65°C水浴；加入体积比依次为25 : 24 : I的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心；取上清，加入浓度为10mg/mlRNase，水浴；抽提后离心取上清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH20充分溶解DNA，备用。
3.根据权利要求2所述的DNA指纹库构建方法，其特征在干，所述DNA提取包括以下步骤将去壳棉种充分粉碎后，加入800 u I SDS提取液，漩涡充分后，65°C水浴30min，间隔IOmin轻摇一次；加入等体积800 u I体积比依次为25 24 I的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混勻至不分层，IOOOOrpm离心IOmin ;取上清，加入浓度为10mg/ml的Iu I RNase, 37 °C水浴30min ;重复抽提一次后离心取上清，加入0. 7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200 u ITE或ddH20充分溶解DNA，备用。
4.根据权利要求I所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，步骤2)每对引物的荧光标记如下
5.根据权利要求I所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，步骤2)所述SSR-PCR扩增反应体系，其中20u L反应液中包括浓度为5m mo I / L的上、下游引物各0. 5 u L、8uL2. 5XBuffer缓冲液、浓度为20ng/uL DNA模板2 u L、浓度为5U/u L Tag聚合酶0.16 u L、8. 84 u LddH2O0
6.根据权利要求I所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，步骤2)所述SSR-PCR扩增反应程序为94°C预变性4min，I个循环；94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸45s，共32个循环；60°C延伸30min，I个循环；15°C保存待用。
7.根据权利要求I所述的DNA指纹库构建方法，其特征在干，步骤3)是将40对引物分别扩增得到的PCR产物稀释5倍后，取I UL稀释液加8. 5 UL去离子甲酰胺和0.5u LLiz-500分子量内标，按照荧光多重PCR组合方式，于DNA分析仪上进行毛细管电泳检测。
8.根据权利要求I所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，所述每对引物的扩增产物的荧光多重PCR组合方式为
9.根据权利要求I所述的DNA指纹库构建方法，其特征在于，步骤3)所述毛細管电泳检测条件为预电泳13kV，3min ；1. 5kV进样IOs ;电泳10kV，40min。
10.SEQ ID No. 1-80所述的引物在构建高通量棉花品种DNA指纹库中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种高通量棉花品种DNA指纹库构建方法，该方法包括提取棉花品种DNA，使用40对引物(核苷酸序列如SEQ ID No.1-80所示)进行SSR-PCR扩增，将扩增产物进行荧光多重PCR组合，于DNA分析仪上进行毛细管五色荧光电泳检测，根据荧光图谱进行棉花品种DNA指纹库构建。本发明方法相比常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测效率提高了10倍以上，且通过分子量内标的自动比对获得扩增产物片段大小，减少人为读板误差的同时，最大程度地保证了数据结果的准确性与可靠性。
文档编号C12N15/10GK102732973SQ20121017001
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月28日 优先权日2012年5月28日
发明者冯新爱, 匡猛, 周大云, 方丹, 杨伟华, 王延琴, 许红霞 申请人:中国农业科学院棉花研究所