专利名称：检测PJVK基因c.437G>A突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因检测领域，具体涉及用于检测PJVK基因突变基因的试剂盒；本发明还涉及PJVK突变基因及其在诊断和/或治疗感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍中的应用。
背景技术：
听神经病/听神经病谱系障碍(Auditory Neuropathy SpectrumDisorders，ANSD)是一种耳蜗外毛细胞功能正常，但声音信号不能同步地从内耳传输到大脑的听觉障碍性疾病，系听觉信息传输处理过程的异常。听力学检查表现为以低频听力减退为主的听力损失，听性脑干反应不能引出，耳蜗微音电位和耳声发射多正常。该类疾病于上个世纪90年代被定义和命名，是一种新认识的听力障碍性疾病，在高危婴幼儿中的发病率约为0. 23%,在各种原因所致的ABR异常的聋病患儿中发病率则高达11%，是导致婴幼儿 和青少年言语交流障碍的重要听力障碍性疾病之一。然而，其病因、病变部位和发病机制尚不十分明确，导致药物治疗、佩戴助听器及人工耳蜗植入术效果的预测和评估上存在难度。近几年来，一系列感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关基因的发现，从分子水平揭示了听神经病谱系障碍的病理机制。根据不同基因导致的不同病变部位对听神经病谱系障碍进行分型，可为听神经病谱系障碍的临床治疗提供理论依据。Starr教授等根据发病部位的不同将其分为TYPE I型(病变部位在听神经)和TYPEII型(病变部位在内毛细胞、末梢树突及突触)国内外研究显示携带OTOF基因突变的听神经病谱系障碍患者临床多以TypeII型表现为主，适合于人工耳蜗植入并可取得较好效果。而携带PJVK基因突变的听神经病谱系障碍患者临床多以TYPE I型为主，其病变部位在听神经，位置深在，人工耳蜗植入术效果欠佳。PJVK基因是与非综合征型隐性遗传性感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关的基因。由Del maghani等于2006年首次发现并命名，也称为DFNB59基因，位于染色体2q31. I 2q31. 3区域，DNA序列全长9800bp，含有7个外显子，其中第一个外显子为非编码外显子。该基因的编码区序列，含终止子如SEQ ID NO. I所示，编码由352个氨基酸组成的蛋白pejvakin (如SEQ ID NO. 2所示)，其中第249 258位氨基酸形成核定位信号基序(nuclear localization signal, NLS),第305 331位氛基酸形成一种可以与DNA相互作用的锌指结构(zinc-binding domains)。Pejvakin蛋白主要表达于耳蜗Corti器、螺旋神经节细胞以及前三级听觉传入通路(耳蜗核、上橄榄复合体、下丘)的神经元细胞中，所致感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍的病变部位主要位于听觉传导通路，影响动作电位的传导及细胞内物质交换。自2006年首次发现并报道PJVK基因至今，学者们分别在伊朗、摩洛哥、土耳其及荷兰等患者中发现了该基因的10余种突变，但少见我国感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者该基因的突变报道。申请人所在课题组针对150名感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者率先开展了该基因的筛查，并发现我国人群特有的c. 437G>A突变，进而研发了检测该基因c. 437G>A突变的试剂盒。该成果有助于快速、高效地在更大范围的感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍人群中进行突变位点的检测，进而对其定位分型，为感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者开展临床干预提供重要的指导意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供用于检测PJVK突变c. 437G>A基因的试剂盒，其技术方案为一种用于检测与感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关的位于PJVK基因的c. 437G>A突变的试剂盒，所述试剂盒包括从待测样品中提取DNA的试剂；用于扩增样本DNA的PCR反应试剂；对PCR扩增产物进行测序的试剂； 其中，所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物，所述PCR弓丨物扩增的目标片段包含PJVK基因第437位碱基。具体地，上述PCR引物为选自PJVK-4F-1 (SEQ ID NO. 3) :5，-CAAATAGAGTCCCCTTCAACAG-3，，PJVK-4R-1 (SEQIDN0. 4) :5’ -CTCCAGTATGCACGTAATTTCA-3’ ；PJVK-4F-2 (SEQ ID NO. 5) :5’ -TGGCTCTACACACATTTGCT-3’，PJVK-4R-2 (SEQ ID NO. 6) :5’ -ACAAGCCTGACTAGAAATTCAA-3’ ；PJVK-4F-3 (SEQ ID NO. 7) :5’ -TACTTTGGCTCTACACACAT-3’，PJVK-4R-3 (SEQ ID NO. 8) :5’ -GCCTGACTAGAAATTCAATAC-3’ ；PJVK-4F-4 (SEQ ID NO. 9) :5’ -GCCTTGATTTACTATTAGGTG-3’，PJVK-4R-4 (SEQ ID NO. 10) :5，-CTATACAACTGCAGCTCTTTC-3，；中的一对。本发明的另一个目的在于提供上述试剂盒用于检测位于PJVK基因的c. 437G>A突变的方法，包括以下步骤I)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA ；2)以该DNA为模板，以PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；其中，所述PCR引物扩增的目标片段包含PJVK基因第437位碱基；3)将得到的PCR反应产物进行直接测序，并将测序结果与PJVK正常基因的序列进行比较，确定是否存在PJVK基因的c. 437G>A突变位点。进一步地，上述检测方法还包括以下步骤4)按照正常阅读框架进行翻译以确定c. 437G>A突变使氨基酸序列自146位发生错义突变，使精氨酸变成组氨酸(P. R146H)。本发明的又一个目的是提供上述试剂盒在用于检测感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍中的用途，为在感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；同时可以指导临床治疗，并为将来利用这一突变作为靶点开展耳聋的基因治疗提供坚实的基础。使用本发明的试剂盒的检测方法为通过检测来自于患者的待测样本中是否存在PJVK基因c. 437G>A突变，而判断该患者感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍发生原因及类型。其中，PJVK基因的c. 437G>A碱基改变引起氨基酸编码过程中在437位发生错义改变，导致编码的精氨酸变成组氨酸(P. R146H),进而影响pejvakin蛋白的正常功能。PJVK基因突变相关的感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍以常染色体隐性遗传的方式传递。发明人应用候选基因筛查的方法对150例非综合征型感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者和99例听力正常且无家族史的对照进行筛查，在一例听神经病谱系障碍患者发现PJVK基因的c. 437G>A突变，而这一突变位点高度保守且在99例正常人对照组中未发现该突变，目前国际上报道与感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关的PJVK突变有10余种，尚无c. 437G>A突变的报道，该突变为中国人群新发现的感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍致病突变。图I给出PJVK编码区氨基酸与核酸碱基的对照图，并示出突变位点(方框标记处)，该突变使位于PJVK基因编码区的第437位的G碱基变为A碱基，使得146位的精氨酸变为组氨酸(P. R146H)，突变发生后影响基因表达蛋白的正常功能。检测该突变可用本领域的任何检测点突变的方法来进行，例如PCR (聚合酶链反应)一测序法、采用标记的PJVK基因DNA探针杂交法或用限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等等。在本发明的一个实施方案中，采用PCR扩增-直接测序法来检测样本，具体包括下述步骤I)采集待测个体的样本，例如血液、体液或组织，提取基因组DNA ；2)以该DNA为模板，以针对PJVK基因或PJVK编码区第437位碱基附近设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物；3)将得到的PCR产物进行直接测序分析，将所得到的序列与PJVK正常基因的序列进行比较，确定是否存在PJVK突变位点。4)根据以上结果判断待测个体是否为PJVK基因突变c.437G>A导致的听神经病谱
系障碍。进一步的，该方法可以选择性的包括如下步骤5)按正常阅读框进行翻译以确定第146位氨基酸是否存在精氨酸到组氨酸的错义突变(p. R146H)。在发明人进行的实验中，通过聋病门诊及资源收集网络收集各种感音神经性耳聋患者，包括听神经病谱系障碍患者，建立资源库。在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA，定量后入库，-20° C保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后，应用在线引物设计软件Primerf设计引物，包含PJVK整个编码区，应用PCR扩增。PCR产物直接测序测序引物与PCR扩增引物相同，正反向测序，应用ABI公司3700DNA测序仪。得到的序列与Genbank中的序列(登录号NC_000002. 11)比较确定PJVK突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定PJVK的突变位点。上述步骤2所得到的PCR反应产物还可以用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的PJVK核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针，也可用限制性酶切的方法筛查是否存在已被确定的突变。
因此，检测PCR扩增产物的试剂选自测序检测试剂、限制性内切酶酶切检测试剂、限制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂和探针杂交检测试剂。在上述方法中使用的PCR引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通常为15 30个碱基，GC含量为45 50%左右，在适当的温度下与末端特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计。在本发明的一个具体实施例中，应用在线引物设计软件primer 3. 0设计了一对PCR引物，其序列为上游引物PJVK-4F-1:5’-CAAATAGAGTCCCCTTCAACAG-3’(nt4328_nt4349)下游引物PJVK-4R-1:5’-CTCCAGTATGCACGTAATTTCA-3，(nt4942_nt4963)
PJVK正常基因的标准序列可以参考例如Genbank NC_000002. 11。用于检测PJVK基因c. 437G>A突变的试剂盒中可以包含以下试剂用于扩增样本DNA中PJVK基因或PJVK基因编码区第437位碱基附近的PCR引物；以及以下一种或几种试剂的组合从待测样品中提取DNA的试剂；PCR反应试剂；对PCR扩增产物进行直接测序的试剂。例如，本发明的一个实施方案中提供一个检测PJVK基因c. 437G>A突变的试剂盒，容器内装有用以检测PJVK基因c. 437G>A突变的成分，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中PJVK基因c. 437G>A突变位点的试剂盒，可含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液、或测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以采用上述的一对PJVK-4F-1和PJVK-4R-1弓丨物，所述用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。所述试剂盒的使用方法主要包括如下步骤(I)提取待测血样的DNA，利用上述的一对PJVK-4F-1和PJVK-4R-1引物，进行PCR反应，得到PCR反应产物；(2)PCR反应产物纯化后直接测序，将所得的序列与Genbank中的标准序列比较确定突变位点的存在；所述步骤还可进一步包括(3)按正常阅读框进行翻译以确定第146位氨基酸是否存在精氨酸到组氨酸的错义突变(P. R146H)。该试剂盒可简便快捷地检测PJVK突变位点，从而应用于感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关基因的检测及其诊断或治疗方法中。本发明也提供了 PJVK突变基因在诊断或治疗人类感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍中的应用。通过检测来自患者的待测样本中是否存在PJVK基因c. 437G>A突变而判断该患者的感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍发生原因及类型，进而为临床诊断和治疗提供依据；此外，在进一步的临床治疗方面，在检测为发生了 PJVK基因c. 437G>A突变之后，可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达，它可与内源性突变基因发生重组，从而可以进行基因治疗。本发明提出了通过检测患者中是否存在PJVK基因新的突变而诊断感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍发生的原因和类型的检测方法，这将有利于为不同类型感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者确定个体化治疗方案。下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的说明，详细描述但不限制本发明。
图I为PJVK基因编码区核苷酸与氨基酸的对照突变位于PJVK基因第437位中的G碱基，用方框圈起来的是突变的碱基和对应的氨基酸，突变后的碱基序列使第146位氨基酸发生精氨酸到组氨酸的错义突变(P. R146H)。图2为本发明方法中PCR反应过程示意图，示出了反应温度和时间，其中*表示每个循环降低0.5°C。图3为本发明方法中，对PCR产物进行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱，图中示出了定量Marker的片段位置。 图4为本发明方法中PJVK基因测序结果的局部图，方框示感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者突变位点位置；其中图4A是PJVK基因杂合突变测序结果；图4B是野生型PJVK基因测序结果。
具体实施例方式本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。实施例I待测血样提取与PJVK基因编码区的PCR扩增一、待测对象血样DNA的制备I、研究对象对150例散发非综合征型感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者和99名无家族史的听力正常对照按照下述方法进行PJVK基因的筛查。150例患者中，I例患者表现为典型的听神经病谱系障碍异常听功能特征，经过的临床观察和系统的听功能检查后确诊为非综合征型听神经病谱系障碍。对这例听神经病谱系障碍患者的PJVK基因检测发现患者为杂合的c. 437G>A突变。对99名听力正常者的筛查中未发现c. 437G>A突变者。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5 10ml。2、基因组DNA提取采用酚氯仿抽提法。第一天I)抗凝血用PBS作I倍稀释。2)在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18° C 28° C)，上面铺一层I倍体积已稀释的血液，室温，IOOOXg,离心20分钟。3)吸弃上清液，小心吸出中间有核细胞层，转入5ml Ep管中，5000 Xg,离心10分钟，然后用PBS洗一次。5000Xg,离心10分钟。4)将细胞悬于 2ml TE 缓冲液(IOmM Tris. HCl, ImM EDTA，pH8. 0)中，加 10% 的 SDS(十二烷基硫酸)至终浓度 0.5% (100 iil)，蛋白激酶 k 100 200 ii g/ml (10mg/ml )，50° C水浴3 5小时。5)用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，5000Xg，离心10分钟。
6)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚氯仿混合物，混匀，5000 Xg,离心10分钟。7)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿异戊醇混合物，混匀，5000 Xg,离心10分钟。8)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。9)加入2. 5倍体积的无水乙醇。10)-20。C 沉淀 DNA 过夜。第二天11)高速离心，10000Xg，10 分钟，4。C。12)弃上清液，加入75%乙醇2ml，高速离心10000 X g，5分钟13)弃上清液,吹干。14)用 TE 缓冲液溶解(200 ii I TE/5ml 全血，400TE/10ml 全血)。15)分装。1%琼脂糖电泳和分光光度计定量。二、PJVK基因编码区的PCR扩增I、引物序列上游引物PJVK-4F-1:5，-CAAATAGAGTCCCCTTCAACAG-3’(nt4328_nt4349)下游引物PJVK-4R-1:5’-CTCCAGTATGCACGTAATTTCA-3’(nt4942_nt4963)注PJVK基因序列检索号NC_000002. 112、PCR反应体系的建立(表I)表IPJVK基因的PCR反应体系
权利要求
1.一种用于检测与感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关的位于PJVK基因的c. 437G>A突变的试剂盒，所述试剂盒包括 从待测样品中提取DNA的试剂； 用于扩增样本DNA的PCR反应试剂； 对PCR扩增产物进行测序的试剂； 其中，所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物，所述PCR弓丨物扩增的目标片段包含PJVK基因第437位碱基。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其中所述PCR引物为选自下述引物中的一对 PJVK-4F-1:5’ -CAAATAGAGTCCCCTTCAACAG-3’，PJVK-4R-1:5’ -CTCCAGTATGCACGTAATTTCA-3’ ；PJVK-4F-2:5，-TGGCTCTACACACATTTGCT-3，,PJVK-4R-2:5> -ACAAGCCTGACTAGAAATTCAA-3’ ；PJVK-4F-3:5， -TACTTTGGCTCTACACACAT-3，,PJVK-4R-3:5’ -GCCTGACTAGAAATTCAATAC-3’ ；PJVK-4F-4:5， -GCCTTGATTTACTATTAGGTG-3，,PJVK-4R-4:5， -CTATACAACTGCAGCTCTTTC-3，。
3.如权利要求I或2所述试剂盒，所述试剂盒用于检测位于PJVK基因的c.437G>A突变的方法，包括以下步骤 1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA； 2)以该DNA为模板，以PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物； 其中，所述PCR引物扩增的目标片段包含PJVK基因第437位碱基； 3)将得到的PCR反应产物进行直接测序，并将测序结果与PJVK正常基因的序列进行比较，确定是否存在PJVK基因的c. 437G>A突变位点。
4.如权利要求3所述试剂盒，其中所述方法进一步包括下述步骤 4)按照正常阅读框架进行翻译以确定c.437G>A突变使氨基酸序列自146位发生错义突变，使精氨酸变成组氨酸(P. R146H)。
5.如权利要求I所述的试剂盒在用于检测感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍中的用途。
全文摘要
本发明提供了检测PJVK基因c.437G>A突变的试剂盒，通过检测患者中是否存在该突变基因而诊断感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍发生的原因和类型。该突变基因和检测方法将有利于临床上开展感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者的PJVK突变筛查工作，为感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者的诊断和治疗提供依据。
文档编号C12Q1/68GK102732614SQ20121017175
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者王秋菊 申请人:中国人民解放军总医院, 王秋菊