专利名称：单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品、其建立方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品制备、其建立方法及其在检测单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。
背景技术：
食品安全是重大公共卫生问题，是制约我国经济发展的重要因素。而微生物污染造成的食源性疾病，是我国食品安全中最突出的问题。近年来，随着食品产业结构的调整、经济全球化与国际贸易的迅速发展，我国食源性疾病的防控面临一系列新问题和挑战。
食品中微生物引起食源性疾病的预防与控制已引起了世界各国关注，食品中微生物的检测技术是预防与控制的关健的技术环节。目前我国食品中微生物的检测仍以传统的病原菌培养、血清抗体检测、和生化特征比较水平为主，不能满足日益发展的检验检疫工作的需要。常规分离培养耗时长，灵敏度低，某些微生物的培养极为困难。随着2007年《食品中致病菌检测方法——实时PCR法》(SN/T1870-2007)和《食品中多种致病菌快速检测方法——PCR法》(SN/T1869-2007)两项检验检疫行业标准的发布实施，以及即将发布实施的《食品中致病菌检测方法一DHPLC法》等系列分子生物学检测国家标准和行业标准。简单快速，灵敏度高的PCR、实时荧光PCR技术，正在食品致病菌检测领域开始发挥重要作用。由于食品中细菌的特殊性，人们很难获得细菌分子生物学检测阳性样品，加之食品中致病菌分子生物学检测技术的研究刚刚起步，而配套的标准样品的研究工作则起步较晚，制备技术复杂，样品定值和不确定度的评估存在很多困难，因而国内外食品致病菌核酸标准样品(定量、定性测试)基本上是一片空白。目前国内外没有适用于食品中致病菌分子生物学检测用核酸标准样品，仅有成套分子生物学检测试剂盒中配备的阳性对照品，价格非常昂贵，也不具备核酸标准样品的效能，不能适时地满足检验检疫工作的需要。研究制备新型的食品致病菌核酸标准样品，对于保证灵敏、特异、快速检测食品中致病菌，具有十分重要的意义。为了解决食品中致病菌核酸标准样品目前国内外均处于空白状况，本项目主要针对食品中致病菌核酸定性和定量检测项目，研究制备食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品。通过对致病菌核酸标准样品的关键制备技术和保存技术的研究，并进行定值技术和定值方式的研究，开展均匀性和稳定性研究，并对食品中致病菌核酸标准样品的不确定度进行深入细致的研究，最终研制出具有较好的均匀性和稳定性的单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品。开发处于世界领先水平，具有我国自主知识产权的食品中致病菌核酸标准样品制备技术；满足食品安全检测的需求，满足国内外食品微生物检测实验室的需求。
发明内容
鉴于食品中致病菌单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品紧缺的状况，根据实际工作的需要和国内现状开展了食品中致病菌核酸标准样品的研制。本项标准样品的制备完成，对全面深入的研究解决食品中致病菌核酸标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌分子生物学检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。加之人们对食品安全方面的关注和重视，以及开展食品中致病菌分子生物学检测工作的日益扩展和重要性，标准样品又是实验室质量控制工作的重要环节，食品致病菌核酸标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。本发明所采用的技术方案是单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes) ATCC :7644的菌株培养、鉴定、核酸标准样品的制备、核酸标准样品的干燥、均匀性和稳定性检查、定性检定、核酸标准样品定值等项工作。取制备的核酸标准样品，经采用实时PCR方法和PCR方法定性分析，确认所制备的核酸标准样品为单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC :7644 核酸样品。米用 PicoGreen DNA 分子突光定量方法及紫外分光光度法，随机抽取样品进行测试，数据进行T检验和F检验确认样品均勻性。经Grubbs检验和Cochran检验,所有数据均可作为定值依据；经正态性检验,这些数据符合正态分布。制备的核酸样品经过了四年的稳定性测定，在避光、密封，_20°C以下温度 贮存，四年内稳定。本发明的一方面在于一种单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)标准样品，其特征在于制备方法的具体步骤如下(一)基因组核酸的提取①单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC :7644经菌株活化、增菌培养；②将步骤①获得的增菌培养液于4000g，4°C离心15min ；③吸弃上清，取沉淀I 3mL，加pH8. 0的TE溶液IOmL悬浮，加0. 5mL浓度为IOOg/L SDS和50 ii L浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37°C温浴Ih ；④加2mL浓度为5mol/L NaCl，混匀，加I. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混匀，65°C温浴 20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液为 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ；⑤取上清，加与上清等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心IOmin ；其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚氯仿异戊醇的体积比为25 24 I ；⑥取上清，加与上清等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心IOmin ;其中，氯仿-异戊醇混合液中氯仿异戊醇的体积比为24 I ；⑦取上清，加上清0. 6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心IOmin ；⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mLpH8. 0的TE溶液溶解，获得单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC :7644基因组核酸溶液；⑨紫外分光光度计测步骤⑧所得产物的260nm和280nm处的光密度值，当OD26tl/OD280比值在I. 7 I. 9之间时，分装核酸样品并进行冷冻干燥；其中，上文所述pH8. 0的TE缓冲液组成10mM Tris-HCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸)配制500ml 的 pH8. 0 的 TE 缓冲液的方法量取 5ml IM Tris-HCl PH=8. 0 和 Iml0. 5MEDTA PH=8. 0的溶液于500ml烧杯中，向烧杯中加入约400ml蒸馏水均匀混合；将溶液
定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存。
(二)冷冻干燥①样品预冻先把步骤I所得的核酸样品溶液在_80°C低温冷冻2h ；②冷冻过程置干燥室制冷，温度降至_35°C时开启冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40°C时，将预冻的核酸样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；待真空度降至0. 5Torr时，结束冷冻过程；③样品干燥干燥室温度设置为15°C，当真空度降至0. ITorr时，关闭真空泵，取出样品，迅速旋紧瓶盖获得单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC 7644基因组核酸标准样品，置于_20°C中避光贮存。本发明的另一方面在于公开一种用于非疾病诊断目的的单核细胞增生李斯特氏菌的Real-Time PCR检测试剂盒，其包括单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)检测基因和阳性标准对照品， I.单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC :7644的检测基因，
包括
单核细胞IfM :个斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的prfA基因PCR引物
—IKI“厂引物 SEQ ID NO I gatacagaaa catcggttgg c 反向 1JI +物 SEQ ID NO； 2 gtgtaatctt gatgccatca g
单核细胞梢4:今斯特氏菌(Ijsieria ntmmcytogenes)特异性实时PCR引物和探针 物 SEQ ID NO 3 ctgaatctca agcaaaacct ggt
反 l“j,j 幽 SEQ ID NO 4 cgcgaccgaa agccaacta
探计 SEQ ID NO 5 y,FAM
-atacgataac atccact.gct ctggctgg -TAMRA-3' |II.所述的阳性标准对照品是按照上述(一广(二)所述的方法制备的单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的标准样品。检测试剂盒的使用方法是以待测样品的基因组为模板，利用单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC :7644检测基因，经过 Real-Time PCR反应，结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线，先制作标准曲线，最后可以利用公式计算待测样品中转基因成分的含量，具体制作和检测方法参照下述具体实施例，上文所描述的使用方法，是本领域技术人员常用的方式，以此为例，本领域技术人员可以通过结合现有技术的公知常识进行更多拓展。本发明中，上述检测试剂盒中，采用了开放式的描述形式，其含义是均未限定检测试剂盒中的其他缓冲液等成分，因其可根据现有技术确定，并通过配置或商业途径购买获得，检测试剂盒的使用方法和检测条件，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本发明不再赘述。本发明的创新特征是本发明解决了国内食品中致病菌核酸标准样品紧缺的状况，对解决食品中致病菌核酸标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌分子生物学检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义，并对开展食品中致病菌分子生物学检测工作，食品致病菌核酸标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。
图I.单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品制备工艺流程；图2. PicoGreen染料进行荧光定量的荧光标准曲线。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。DNA提取、PCR反应试剂等基因工程实验中所用试剂均购于宝生物工程(大连)有限公司；DNA提取试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司(货号D9093)；TaqMan Universal Master Mix :购于 ABI 公司；引物和探针宝生物工程(大连)有限公司合成；实时荧光定量PCR仪ABI 7500型。实施例I菌株来源制备单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品所用标准菌株购自于美国标准菌种收藏所(American Type Culture Collection),单核 细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)标准菌株号ATCC :7644。图I为单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品制备工艺流程图。本文中，涉及基因工程操作方面的实验步骤、实验试剂配制等方法，如无特殊说明，均参考文献《分子克隆实验指南》。细菌基因组核酸的提取方法按照GB/T4789. 30-2008[1]进行菌株活化、增菌培养。提取增菌肉汤的DNA，制备核酸标准样品。(I)取细菌增菌培养液IOOmL,加到500mL无菌离心管中，4000g,4°C离心15min ；(2)吸弃上清，取沉淀lmL，加TE溶液(pH8. 0) 10mL，悬浮，加0. 5mL 100g/L十二烧基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate, SDS)和 50 u L 蛋白酶 K (20mg/mL),混勻，37°C温浴Ih ；(3)加 2mL NaCl (5mol/L)，混匀，加 I. 5mL CTAB-NaCl 混合溶液(100g/L CTAB 和0. 7mol/L NaCl)，混匀，65°C温浴 20min ；(4)取上清，加等体积酚-氯仿-异戊醇混合液，(混合液中酚氯仿异戊醇的体积比为25 24 1)，混匀，6000g离心IOmin ;(5)取上清，加等体积氯仿-异戊醇混合液(混合液中氯仿异戊醇的体积比为24 1)，混匀，6000g 离心 IOmin ;(6)取上清，加0. 6倍体积异丙醇，轻轻混匀，13000g离心IOmin ；
(7)取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL TE溶液(pH8. 0)溶解，此即为细菌基因组核酸溶液。其中，上文所述pH8. 0的TE缓冲液组成10mM Tris-HCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸)配制500ml 的 pH8. 0 的 TE 缓冲液的方法量取 5ml IM Tris-HCl PH=8. 0 和 Iml0. 5MEDTA PH=8. 0的溶液于500ml烧杯中，向烧杯中加入约400ml蒸馏水均匀混合；将溶液
定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存。细菌基因组DNA的质量检查[2](I)直接法——DNA完整性确认用提取的DNA直接电泳检查，1%琼脂糖凝胶电泳，检查结果表明电泳条带清晰明亮，条带单一，无杂带，无RNA，说明提取的DNA质量很好，核酸具有完整性和高分子量。·(2)紫外分光光度计法用紫外分光光度计来检测提取DNA的0D23(I、OD260, OD280光吸收值。取5 ii L DNA溶液加ddH20梯度稀释至lmL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。当0D26Q/0D28Q比值在I. 7 I. 9之间时，适宜于PCR扩增。测试结果表明0D23(l/0D■值小于0. 7，0D26(I/0D■值为I. 9，结果表明所提取的核酸标准样品DNA质量很好。单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品的分装及干燥分装根据所提取的核酸样品初定值浓度，计算每管分装体积，分装样品；每管单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸样品含量约为5 U g，将获得的核酸标准样品分装于内置微量管的样品套管中，分装400管。冷冻干燥程序( I)样品预冻先把核酸样品溶液在_80°C低温冷冻2h。(2)冷冻过程关好冰冻干燥机的干燥室门，开始干燥室制冷；干燥室温度降至_35°C时，开始冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至_40°C时，将预冻的标准样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空，真空表显示值开始下降；待真空度降至0. 5Torr时，结束冷冻过程。(3)样品干燥对干燥室加热，提高样品干燥速度；干燥室的温度设置为15°C。当真空度降至0. ITorr或更低时,表示样品已干燥好。(4)关闭真空泵，使干燥室与外界大气相通，待内外气压平衡后，打开干燥室门，取出样品，迅速旋紧瓶盖。核酸样品按以上冷冻干燥程序制成冻干粉，即单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品；分装后的样品加贴唯一丨丨生标识，放置于-20°C中避光贮存。实施例2一定性检定IPCR 分析
a.仪器PE2400，美国PE公司b.测定取制备的核酸标准样品，经PCR分析测定
单核细胞增牛.个斯特氏菌(Listeria monocytogenes )的prfA基W PCR rH'Wj: Jl:向 ‘j|物 SEQID NO； I gatacagaaa catcggttgg cJxfiiJ1Jjtt SEQID NO: 2 gtgtaatctt gatgccatca g反应条件预变性94°C,3min ;进入循环94°C变性60s，60°C退火60s，72°C延伸60s，35次循环；
终止延伸72°C，7min;扩增产物长度为210bp，扩增出单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)特异性基因片段,测序后结果证实为单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)。2实时荧光PCR分析a.仪器ABI 7500型实时荧光定量PCR分析仪b.测定取制备的核酸标准样品，应用单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)特异性引物和探针,经实时突光定量PCR分析测定
1丫核细胞增I':个斯恃氏1 ' (JJs/erki matwcylogcncs)特汁性实时PCR <j|物和探针I
if; ('1J1JI ft SEQID NO 3 ctgaatctca agcaaaacct ggt反丨“j 引物丨 SEQ ID NO: 4 cgcgaccgaa agccaacta
探针 j SEQ ID NO 5 5'-FAM- atacgataac atccacggct ctggctgg -TAMRA-3'_|其中FAM 为 6-carboxyfluorescein, TAMRA 为6-carboxytetramethyIrhodamine ；PCR所用试剂购于宝生物，使用宝生物Premix Ex Taq试剂盒，货号DRR039S。FAM (羧基荧光素)吸收波长492nm，发射波长518nm。反应条件37°C，5min ;95°C预变性3min ;95°C变性5s;60°C退火延伸40s，同时收
集FAM荧光，进行40个循环。4°C保存反应产物。经ABI 7500型实时荧光定量PCR分析仪检测，结果证实为单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes):阴性对照检测结果显不，FAM通道无突光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果显示，FAM通道有荧光信号检出，反应结果正常根据以上PCR和实时荧光PCR分析的结果，可得出如下结论定性分析结果表明所制备获得的DNA核酸标准样品为单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品。二定值方法采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法[3 5]测定单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品,进行标准样品定值。
I.试剂、耗材、主要仪器Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits invitrogen 公司，包括Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent、20 X TE、ADNA 标准样品；黑色平底96孔板Greiner公司。多功能酶标仪TECANGENios PLUS2. DNA标准曲线绘制(a) DNA标准样品稀释、检测 ①100ug/mL的入DNA标准样品，用TE稀释成2ug/mL DNA贮存液。②2ug/mL的X DNA标准样品贮存液按表I进行稀释。③每个反应孔按表I所示，再加入ImL Quant-iTTM PicoGreen试剂,混勻,在室温避光孵育2-5min。④多功能酶标仪检测。表IDNA标准曲线配制
权利要求
1.一种单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)标准样品,其特征在于制备方法的具体步骤如下 I 基因组核酸的提取 ①单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)ATCC :7644,经菌株活化、增菌培养； ②将步骤①获得的增菌培养液于4000g，4°C离心15min； ③吸弃上清，取沉淀I 3mL，加pH8.0的TE溶液IOmL悬浮，加0. 5mL浓度为100g/L SDS和50 ii L浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37°C温浴Ih ； ④加2mL浓度为5mol/LNaCl，混匀，加I.5mLCTAB-NaCl混合溶液，混匀，65 °C温浴20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液为 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ； ⑤取上清，加与上清等体积的酹-氯仿-异戍醇混合液，混勻，6000g离心IOmin;其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚氯仿异戊醇的体积比为25 24 I ； ⑥取上清，加与上清等体积的氯仿-异戍醇混合液，混勻，6000g离心IOmin;其中，氯仿-异戊醇混合液中氯仿异戊醇的体积比为24 : I ; ⑦取上清，加上清0.6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心IOmin ； ⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mLpH8. 0的TE溶液溶解，获得单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC :7644基因组核酸溶液； ⑨紫外分光光度计测步骤⑧所得产物的260nm和280nm处的光密度值，当0D26(l/0D28(l比值在I. 7 I. 9之间时，分装核酸样品并进行冷冻干燥； II 冷冻干燥 ①样品预冻先把步骤I所得的核酸样品在_80°C低温冷冻2h； ②冷冻过程置干燥室制冷，温度降至_35°C时开启冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40°C时，将预冻的核酸样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；待真空度降至0. 5Torr时，结束冷冻过程； ③样品干燥干燥室温度设置为15°C，当真空度降至0.ITorr时，关闭真空泵，取出样品，迅速旋紧瓶盖获得单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC :7644基因组核酸标准样品，置于_20°C中避光贮存。
2.一种用于非疾病诊断目的的单核细胞增生李斯特氏菌的Real-Time PCR检测试剂盒，其特征在于，包括单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)检测基因和阳性标准对照品， I.单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的检测基因,包括 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的prfA基因PCR引物 正向引物 SEQIDN0:1 反向引物 SEQ ID NO :2 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)特异性实时PCR引物和探针 正向引物 SEQ ID NO :3 反向引物 SEQ ID NO :4 探针SEQ ID NO 5 II 所述的阳性标准对照品是权利要求I所述的单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes) ATCC :7644 的标准样品。
全文摘要
本发明公开一种单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品、其建立方法及应用，其通过菌株培养、鉴定、核酸标准样品的制备、核酸标准样品的干燥、均匀性和稳定性检查、定性检定、核酸标准样品定值等项工作,获得一种单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品。本发明解决了国内食品中致病菌核酸标准样品紧缺的状况，对解决食品中致病菌核酸标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌分子生物学检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义，并对开展食品中致病菌分子生物学检测工作，食品致病菌核酸标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。
文档编号C12N15/10GK102676506SQ201210172208
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者于兵, 徐君怡, 曹际娟, 赵昕 申请人:于兵, 徐君怡, 曹际娟, 赵昕