专利名称：Isg15基因作为羊疾病抗性相关的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及羊的分子标记辅助选择技术领域，尤其是一种ISG15基因作为羊疾病抗性相关的分子标记及其应用。
背景技术：
疾病是影响畜禽生产效益的重要因素之一。现代化工业化的饲养方式不仅损害动物福利，使动物对疾病的易感性增加；同时也因人类与家畜的密切接触，增加了人畜共患病互感的可能性；而畜禽及产品的全球贸易流通以及交通的快速畅达，更增大了人畜共患传染病的流行频率，扩大了传染范围。虽然生物制品和抗生素的应用能在一定程度上缓解动物疫情，但疫苗和药物的使用只能预防、控制疾病而不能根除疾病，解决这一问题的根本途径是培育高抗病力的畜禽品种。 干扰素刺激基因15 (IFN-stimulated gene 15，ISG15)是目前首个发现的类泛素蛋白，干扰素刺激及病毒感染均可以强烈诱导其表达。干扰素结合细胞膜受体，借助JAK-STAT信号通路激活ISG15的表达，进而编码抗病毒蛋白，达到抗病毒特性。ISG15及其对蛋白质的共价修饰可有效刺激细胞增殖和NK细胞成熟，产生IFN- Y蛋白，激活嗜中性粒细胞，促进树状细胞成熟，增强细胞抗病毒作用，因而在干扰素调控的过程中发挥着重要作用。研究发现ISG15具有广谱抗病毒作用，其对I型人体免疫缺陷病毒、A/rffSN型流感病毒、B/Lee型流感病毒、I-型单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、呼吸道合胞病毒、痘苗病毒、重组Sindbis病毒、丙型肝炎病毒、Ebola VP40病毒、牛病毒性腹湾病毒都具有抗病毒作用。同时，ISG15在细菌感染、获得性免疫方面也具有重要的作用。作为我国特有的宝贵绵羊品种资源，湖羊集性成熟早，早期生长快、繁殖力强、四季发情、泌乳性能好，及终年舍词、抗病力强等多种优异特性于一体。此外，湖羊具有的极强环境适应能力，在炎热潮湿的江南和干寒沙漠的西北，都能保持生长速度快、繁殖率高、抗病能力强等优良特性，因此，申请人开展了羊ISG15基因序列的克隆、SNP筛查与检测及其与羊疾病抗性的关联分析。
发明内容
本发明的目的正是要解决上述技术存在的不足，而提供一种ISG15基因作为羊疾病抗性相关的分子标记及其应用，作为羊标记辅助选择的、与羊疾病抗性相关的分子标记的克隆及应用，本发明的分子标记与ISG15基因有关。本发明目的在于克隆与羊疾病抗性相关的分子标记，利用该分子标记作为羊标记辅助育种的应用。本发明解决其技术问题采用的技术方案这种ISG15基因作为羊疾病抗性相关的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO : I所不,在序列表SEQ ID N0:1的第235bp处有一个A235-C235的碱基颠换。
更进一步的，克隆羊ISG15基因的引物对的DNA序列如SEQ ID NO :2和SEQ IDNO 3所示。所述的分子标记在羊分子标记辅助育种中的应用。所述的引物对在羊分子标记辅助育种中的应用。本发明所述的一种制备上述分子标记和检测上述分子标记的方法，该方法的步骤如下用羊ISG15基因设计引物，扩增得到目的片段；从羊外周血中提取基因组DNA，以羊ISG15基因DNA序列为模板设计引物，PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，应用PCR-SSCP方法检测羊ISG15基因的多态性，并初步进行了其基因型与羊疾病抗性之间的关联分析的应用，为羊的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。 本发明有益的效果是在湖羊群体中发现野生纯合型AA、突变杂合型AC和突变纯合型CC这3种基因型。本发明还公开了扩增ISG15基因部分内含子区所用的引物以及用于分子标记的检测方法。本发明为羊的标记辅助选择提供了 I个新的分子标记。克隆与羊疾病抗性相关的分子标记，利用该分子标记作为羊标记辅助育种的应用。
图I :是本发明的技术流程图。图2 :是本发明中羊ISG15基因扩增序列的电泳图谱，片段大小为313bp (琼脂糖胶浓度为I. 5%)。图中M为DNA分子量标记(DL2000plus)。图3 :湖羊ISG15基因突变纯合型BB基因型个体序列的与牛全基因组数据库BLAST比对结果。图4:是本发明中羊ISG15基因突变纯合型个体测序发现在序列表SEQ ID NO 1的235bp处有一个A235-C235的碱基颠换。图5 :是本发明中羊ISG15基因PCR-SSCP的3种带型(AA、AB和BB对应序列表SEQID NO: I的235bp处AA、AC和CC这3种基因型。)
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明序列表SEQ ID NO: I是本发明克隆及用于PCR-SSCP检测的羊疾病抗性相关基因I SG 15基因的DNA序列。序列表SEQ ID NO: 2是本发明中用于克隆及PCR-SSCP检测羊疾病抗性相关基因ISG15基因DNA突变的PCR-SSCP上游引物。序列表SEQ ID NO: 3是本发明中用于克隆及PCR-SSCP检测羊疾病抗性相关基因ISG15基因DNA突变的PCR-SSCP下游引物。图 3 的说明Bos taurus breed Hereford chromosome 16genomicscaffold, Bos_taurus_UMD_3. I,whole genome shotgun sequenceLength=1662458权利要求
1.一种ISG15基因作为羊疾病抗性相关的分子标记，其特征在于其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示，在序列表SEQ ID NO 1的第235bp处有一个A235-C235的碱基颠换。
2.根据权利要求I所述的ISG15基因作为羊疾病抗性相关的分子标记，其特征在于扩增所述分子标记的引物对，其DNA序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
3.根据权利要求I所述的ISG15基因作为羊疾病抗性相关的分子标记，其特征在于所述的分子标记在羊分子标记辅助育种中的应用。
4.根据权利要求2所述的ISG15基因作为羊疾病抗性相关的分子标记，其特征在于所述的引物对在羊分子标记辅助育种中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种ISG15基因作为羊疾病抗性相关的分子标记及其应用，从羊ISG15基因中克隆获得一种作为分子标记应用的与羊疾病抗性相关的基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，该基因在SEQ ID NO1的处有一个A235-C235的碱基颠换。本发明有益的效果在湖羊群体中发现野生纯合型AA、突变杂合型AC和突变纯合型CC这3种基因型。本发明还公开了扩增ISG15基因部分内含子区所用的引物以及用于分子标记的检测方法。本发明为羊的标记辅助选择提供了1个新的分子标记。
文档编号C12N15/11GK102776180SQ20121017681
公开日2012年11月14日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者吴建良, 周卫东, 姜俊芳, 宋雪梅, 蒋永清, 郑会超, 黄新 申请人:浙江省农业科学院