专利名称：快速检测食品中单核增生李斯特菌的方法
技术领域：
本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种快速检测食品中单核增生李斯特菌的方法。
背景技术：
目前，李斯特菌属共包含8个种，而绝大多数人体感染的李斯特菌都与单核增生李斯特菌monocytogenes')有失。对于非孕妇的的个体,单核增生李斯特菌感染会引起脑膜炎和脑膜脑炎；对于孕妇，主要感染还未出生的婴儿。在感染过程中单核增生李斯特菌可以从一个细胞扩散到邻近的其他细胞。通常单核增生李斯特菌会在腐烂的植物体和泥土中发现，同时它也会通过饮水和食物进入家畜的体内并定植在其胃肠道。人体会因食用 受感染的家畜的肉或奶而患病。食用受单核增生李斯特菌污染的食物，例如干酪、香肠、牛奶等，是其感染的主要途径，其致死率可高达30%。供食用的家畜及其相关产品是单核增生李斯特菌污染的主要来源。因此，为了确保食品安全，在食物生产的各个环节控制微生物的污染相当重要。目前，对于单核增生李斯特菌检测主要的方法还是培养法和血清学的检测方法，包括富集、选择性培养、生化鉴定。血清分型，有时还要进行毒性检测。如(杨瑞军，生肉食品中致病菌检测结果分析[J]中国卫生检验杂志.2009:19 (9)2122-2125)，传统的方法具有劳动强度高、耗时、费用高等缺点。此外，传统方法检测灵敏度比较低而且特异性不强，尤其对于来源相近的菌株，传统方法很难通过生理生化的方式加以区分。因此，为了确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的单核增生李斯特菌。
发明内容
本发明是目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、使用方便、检测快速高效、灵敏度高的单核增生李斯特菌快速检测方法。本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的
包括如下步骤
(I)取食物样本，加缓冲液碾磨制成匀浆液，离心去除大的食物残渣，取上清得菌悬液，整过程均为无菌操作；缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。(2)取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙啶(PMA)溶液，使PMA的终质量浓度为3 μ g/mL,混勻后室温避光培养3 ^8min (优选为5min),齒素灯曝光,光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA ；PMA溶液配制方法为PMA溶解于二甲亚砜(DMS0)中，配制成O. 5 mg/mL的PMA溶液，_20°C避光保存。(3 )取DNA，进行LAMP反应，LAMP反应所用的引物为
上游外引物 F3 (5，一 3，): AAGCTGCTTTTGATGCTG
下游外引物 B3 (5，一 3’) TCGATTAAAAGTAGCGCCTT
上游内引物 FIP (5，— 3，)CGGCTTTGAAGGAAGAATTTTTGAT-CGTAAGCGGAAAATCTGTC下游内引物 BIP (5，一 3，)TACGGAGGTTCCGCAAAAGA-TTTTCAAAATATCGCGTAAGTCTC 上游环引物 LF (5，一 3，): ATTTGTTAGTTCTACATCACCTG 下游环引物 LB (5，一 3，):AAGTTCAAATCATCGACGGC
为了达到更好的反应效果，LAMP反应条件为0. 8 M甜菜碱，2 mM MgS04, I. 4 mMdNTP, 1.6 uM 内引物 FIP/BIP, 0.4 uM 外引物 F3/B3, 0.8 uM 环引物 LF/LB ;将扩增反应体系于62 °C孵育45 min, 85 0C孵育5 min，终止反应。
(4) LAMP反应结束后，取反应液检测单核增生李斯特菌存在。取反应液检测单核增生李斯特菌存在可以为取反应液用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有梯度条带处在，且最小条带为180 bp，则说明有单核增生李斯特菌存在；或取反应液加入SYBR green I荧光检测，若反应液出现绿色，则说明有单核增生李斯特菌存在。与现有技术相比，本发明有如下有益效果
1、采用本发明的检测单核增生李斯特菌的时间更短，可在2.5个小时内得到结果，同时本发明克服了一般的分子生物学检测方法无法区分死菌与活菌的缺陷；
2、本发明针对单核增生李斯特菌的特异性基因设计特异性引物，并特定的反应条件，可在62° C，45 min内的出结果。3、取反应液检测单核增生李斯特菌存在，可以无需电泳检测，直接可通过荧光观察，操作简便，结果判定简单，降低了检测成本。单核增生李斯特菌作为一种主要的食源性致病菌，在公共卫生、食品安全。兽牧兽医和出入境检验检疫中必须的检测指标。随着社会经济的发展和国际贸易量的与日俱增。急需建立一种从田园到餐桌的一种快速、准确、简便的细菌检测方法。结合了 PMA处理的LAMP检测技术更具有重要意义。
图I LAMP扩增结果，PC为阳性对照，NC为阴性对照。(A)在自然光照条件下PC在管底出现白色沉淀，NC反应液为澄清液；(B)在自然光照条件下，加入SYBR green I后，PC出现绿色，NC呈淡黄色；(C)在紫外光照条件下，加入SYBR green I后，PC出现亮绿色，NC呈淡黄色；(D)经2%琼脂糖凝胶电泳后，PC出现阶梯状条带，NC物任何条带。图2 PMA处理去除死的单核增生李斯特菌的干扰。(A)经PMA处理或不处理的活单核增生李斯特菌与热致死单核增生李斯特菌基因组DNA提取结果；(B) (C)各组合所提取的基因组作为模板进行的LAMP检测的结果。各组单核增生李斯特菌的浓度为IO6 CFU/mL。图3 LAMP检测的特异性验证。图4 LAMP检测的灵敏度验证。1-5非别是10梯度稀释的单核增生李斯特菌，其浓度从 I. 2 X IO5 到 I. 2 X IO1 CFU/mL。
具体实施方案下面结合具体实施例，进一步阐释本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件是实验方法，通常按照常规条件中的条件，或按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可很容易地从公开是商业渠道获得。
实施例I.食物样本预处理
称取I g的食物样本，加入9ml的磷酸盐缓冲液(PBS)，碾磨制成匀浆液，900 g离心5min，去除大的食物残渣，取上清(该过程必须无菌操作)。2. PMA 处理
PMA溶解于二甲亚砜(DMS0)中，配制成O. 5 mg/mL的PMA溶液，_20°C避光保存。取500 μ L制备好的菌悬液置于I. 5 mL微量离心管中，加入3 μ L O. 5 mg/mL的PMA溶液，使PMA的终质量浓度为3 μ g/mL ；PMA与菌悬液混合均匀后在室温条件下避光培养5 min, 利用500 W的卤素灯曝光5 min，光照交联时样品置于冰上(避免过热)，且在距光源20 cm处，交联后的悬浮液于10000 g离心5 min,所得沉淀用于DNA的提取。3.基因组DNA的提取
经步骤2获得的样品在10000 g,4°e条件下离心5 min,弃上清,并小心吸走残余液体，加入30 μ I无菌的去离子水100°C煮沸10 min,待冷却后12000 g，4 oC条件下离心5 min,取上清作为LAMP反应模板，制备的模板应立即用于检测。4.选取靶点及设计引物
(2)LAMP检测:将扩增反应体系于62 0C孵育45 min,85 0C孵育5 min，终止反应所述 25 PL 扩增反应体系包括2.5 μ IOX thermal buffer (200 mM Tris -HCl, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 80 mM MgSO4, 1% (w/v) Triton X-100, pH 8. 8 ),0. 8 M 甜菜喊(Sigma, Santa Clara, CA), 2 mM MgSO4, I. 4 mM/dNTP (TaKaRa, Dalian,China), I. 6 uM FIP/BIP, 0.4 uM F3/B3, 0.8 uM LF/LB, I. 0 μ (8 U) Bst DNA 聚合酶(8000 U/mL, New England Biolabs,北京，中国)，5 M-L 模板 DNA,添加无菌水至 25μ 。 LAMP 反应所用的引物对用在线软件(http: //primerexplorer. ip/e/index,html)设计
上游外引物 F3 (5，一 3，): AAGCTGCTTTTGATGCTG 下游外引物 B3 (5，一 3’) TCGATTAAAAGTAGCGCCTT
上游内引物 FIP (5，— 3，)CGGCTTTGAAGGAAGAATTTTTGAT-CGTAAGCGGAAAATCTGTC 下游内引物 BIP (5，一 3，)TACGGAGGTTCCGCAAAAGA-TTTTCAAAATATCGCGTAAGTCTC 上游环引物 LF (5，一 3，): ATTTGTTAGTTCTACATCACCTG 下游环引物 LB (5，一 3，) AAGTTCAAATCATCGACGGC
摸索LAMP反应的条件，包括反应温度，反应时间，Mg2+浓度，甜菜碱浓度等。最终得出该LAMP反应的最优条件为0.8 M甜菜碱，2 mM MgS04, I. 4 mM dNTP, 1.6 uM内引物FIP/BIP, O. 4 uM外引物F3/B3，O. 8 uM环引物LF/LB，反应温度为62。C，反应时间为45 min。选取最优的条件，并采表I提供的菌株进行引物特异性验证，菌株的编号和来源见表I。表I供试菌株及检测结果
权利要求
1.一种快速检测食品中活的单核增生李斯特菌(Zisteria monocytogenes)的检测方法，其特征在于包括如下步骤 (1)取食物样本，加缓冲液碾磨制成匀浆液，离心去除大的食物残渣，取上清得菌悬液，整过程均为无菌操作； (2)取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙啶溶液，使叠氮溴化丙啶的终质量浓度为3u g/mL，混匀后室温避光培养3 8min，卤素灯曝光，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA ； (3)取DNA，进行LAMP反应，LAMP反应所用的引物为 上游外引物 F3 (5，一 3，): AAGCTGCTTTTGATGCTG 下游外引物 B3 (5，一 3’) TCGATTAAAAGTAGCGCCTT 上游内引物 FIP (5，—3，)CGGCTTTGAAGGAAGAATTTTTGAT-CGTAAGCGGAAAATCTGTC 下游内引物 BIP (5，一3，)TACGGAGGTTCCGCAAAAGA-TTTTCAAAATATCGCGTAAGTCTC 上游环引物 LF (5，一 3，): ATTTGTTAGTTCTACATCACCTG 下游环引物 LB (5，一 3，) AAGTTCAAATCATCGACGGC (4)LAMP反应结束后，取反应液检测单核增生李斯特菌存在。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述的缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)所述PMA溶液配制方法为PMA溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成0. 5 mg/mL的PMA溶液，_20°C避光保存。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)中混匀后室温避光培养5min。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(3)所述LAMP反应条件为0.8 M甜菜碱，2 mM MgS04, I. 4 mM dNTP, I. 6 uM 内引物 FIP/BIP, 0. 4 uM 外引物 F3/B3, 0. 8uM环引物LF/LB ;将扩增反应体系于62 °C孵育45 min，85 0C孵育5 min，终止反应。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(4)所述取反应液检测单核增生李斯特菌存在为取反应液用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有梯度条带处在，且最小条带为180 bp，则说明有单核增生李斯特菌存在；或取反应液加入SYBR green I荧光检测，若反应液出现绿色，则说明有单核增生李斯特菌存在。
全文摘要
本发明公开了一种单核增生李斯特菌的环介导等温扩增的检测方法。本发明针对单核增生李斯特菌设计和筛选了一套特异性检测引物，采用LAMP对待检测食物样品进行检测，确认是否存在单核增生李斯特菌的特异性基因片段，进而确定待检测样品是否受到单核增生李斯特菌污染。此外，在进行LAMP检测前，本发明还通过叠氮溴化丙锭处理食物样品以去除死菌的干扰，从而在随后进行的LAMP检测中只会有活菌的检测信号。本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短，不需要昂贵的实验仪器，操作过程简单，并且不会被食物样品中残留的DNA或死菌的干扰，特别适合在野外和基层检测机构和食品企业中自检使用。
文档编号C12R1/01GK102719535SQ20121017717
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者徐锋, 杨友均, 熊勇华, 许恒毅, 赖卫华, 郭亮, 魏华 申请人:南昌大学