一种筛选功能菌群的方法

专利名称：一种筛选功能菌群的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选功能菌群的方法。
背景技术：
目前菌种的筛选方法一般有如下两种単一菌的纯化筛选和自然发酵物菌剂的筛选制备。単一菌的纯化筛选是根据所需的功能要求从自然界中分离、纯化，得到目的単一菌；自然发酵物菌剂筛选是将自然材料按ー定比例混合堆积，使其在自然条件下缓慢发酵，得到自然发酵菌剂。但是上述两种菌筛选方法均有不足， 影响其实际应用价值。单ー菌在纯化过程中，一方面失去了与自然条件下长期处于协同关系的其它菌共存的机会，导致该单ー菌功能大大降低；另ー方面，単一菌的纯化使其对生长条件的适应范围越来越狭窄，对发酵条件要求高，发酵成本昂贵；再者，单ー菌孤立生长，容易受到其它菌的污染和抑制，难以生长和发挥功能。自然发酵物菌剂中所含的菌种是在自然的被动发酵过程中无序地集合而成的多菌联合体，无法掌握其菌种组成，缺乏科学性，使用效果难以控制；而且自然发酵物菌剂的发酵过程遵循被动的自然循环规律，其分解效率低，效果不稳定。因此，为了提高生产效率，需要建立一种高效的菌筛选方法，使得到的菌保留原来功能、应用成本低且效果可控。

发明内容
本发明的发明人经过长期的研究，发现当微生物从原来栖息的生境中分离、纯化培养时许多功能被削弱或丧失。因此，多数微生物是形成ー种特殊群体，依靠群体内部各成员的协同作用才充分发挥应有的功能的。由此，本发明发明人发明了如下保留协同作用菌群的菌分离方法。以微生物群的功能为核心，在不破坏功能群体的协同关系的前提下，采用各种限制性手段逐渐排除与功能无关的微生物种类，保留核心功能群体，定向驯化成高效而稳定的协同群体。其中的稳定包括微生物功能的稳定和菌种组成的稳定。功能稳定表现在经过多次的继代，菌种功能不退化并且抗逆性强(更广的PH适用范围、更广的适用温度等)，菌种稳定性表现在经过多代的继代培养，菌种组成不发生变化。本发明的ー个目的是提供一种筛选功能菌群的方法。本发明所提供的筛选功能菌群的方法，由如下步骤组成I)选取含有功能菌群的基质；2)将所述基质接种于限制性培养基中进行培养，再传代培养；3)建立评价所述功能菌群功能的指标；在每代培养过程中检测所述指标和检测所述功能菌群中菌种组成是否稳定；4)若在某代培养过程中，所述指标符合对所述功能菌群的功能要求，且所述菌种组成稳定，则所述某代培养过程中得到所述功能菌群；所述限制性培养基为所述功能菌群在其中生长而非所述功能菌群不在其中生长
的培养基。
上述过程中，所述培养的条件与所述功能菌群在所述基质中生存的条件相同。所述培养的条件为温度、光照、厌氧或好氧等。上述过程中，所述功能菌群具体可为分解木质纤维素的菌群。上述筛选分解木质纤维素的菌群的过程中，所述基质可为秸杆柴垛腐烂的垛底、常年堆积的秸杆及树叶。上述筛选分解木质纤维素的菌群的过程中，所述限制性培养基由终浓度为5g/L的蛋白胨、终浓度为lg/L的酵母提取物、终浓度为5g/L的NaCl、终浓度为lg/L的K2HPO4,终浓度为O. 35g/L的MgSO4 · 7H20、终浓度为3g/L的CaCO3和终浓度为O. lg/L (作为底物)的秸杆组成；所述终浓度为各物质在所述限制性培养基中的浓度。上述筛选分解木质纤维素的菌群的过程中，所述评价所述功能菌群功能的指标为 秸杆分解率；所述指标符合对所述功能菌群的功能要求为秸杆分解率在所述传代培养的各代间稳定。上述过程中，所述功能菌群还可为用于制备秸杆发酵饲料的菌群。上述筛选用于制备秸杆发酵饲料的菌群的过程中，所述基质为农作物秸杆、农作物赖以生长的土壤或农作物秸杆与农作物赖以生长的土壤的混合物；所述培养基为R-MRS
培养基。上述筛选用于制备秸杆发酵饲料的菌群的过程中，所述评价所述功能菌群功能的指标为乳酸产率和PH值下降速度；所述指标符合对所述功能菌群的功能要求为所述乳酸产率在所述传代培养的各代间稳定，和所述PH值下降速度12小时可将pH从6. 4降至3. 8。上述任一所述过程中，所述检测所述功能菌群中菌种组成是否稳定的方法为在所述传代培养过程中，PCR扩增每代培养中的所述功能菌群的16S rDNA基因，得到各代的PCR扩增产物，比较各代的PCR扩增产物的图谱，若图谱稳定不变，则所述功能菌群中菌种组成稳定。上述方法中，所述基质具体可以为根据所需要的功能从自然界中或其它环境中选择的具有所需功能菌群的基质，如菌群附着的材料(如枯枝烂叶、土壌、植物材料等)。上述方法中，是用适宜优势菌生长的限制性培养基进行选择培养来逐步淘汰功能弱、适应性弱的其它杂菌的，并且在培养基中添加1% -5%的秸杆、植物材料或待降解物作为底物；选择培养的条件需模拟所需功能菌群在基质中生存时的条件。上述方法中，所述指标，具体可以根据筛选目的而定，简便、直观更好。实际应用中，本领域技术人员事先知道要筛选什么类型的功能菌群，如分解纤维素的菌群，通过现有技术也知道所要筛选的功能菌群适合什么培养基及适合什么培养条件。本发明方法得到的功能菌群能够继续保持各种菌间的协同作用，组成稳定，功能強大，不会因为从自然界的分离而削弱作用力；另外，本发明方法操作简单、成本低廉，省时省力。因此，本发明方法在功能菌的筛选领域将会有广阔的应用前景。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例I、筛选分解木质纤维素的复合菌群一、复合菌群的筛选I、菌源将秸杆柴垛的腐烂垛底作为菌源。因为秸杆柴垛中的秸杆的主要成分是木质纤维素，柴垛腐烂表明是秸杆腐烂，进而说明是木质纤维素被降解，木质纤维素被降解一定是由于分解木质纤维素的菌群所致， 由此可断定腐烂的秸杆中一定含有分解木质纤维素的菌群，则腐烂垛底中一定含有分解木质纤维素的菌群，所以将腐烂垛底作为菌源；腐烂垛底为分解木质纤维素的菌群的栖息基质，其中含有腐烂秸杆、土壌、分解木质纤维素的菌群等。2、限制性培养和筛选实验组取5. Og菌源样品接种到盛有150ml限制性培养基的500ml三角瓶中，三角瓶中含有已灭菌的O. 15g水稻稻杆和lcmX6cm的滤纸条,在室温(34°C )、150rpm/min条件下震荡培养，至滤纸条顔色变为黄色(记作第O代培养)，将三角瓶中的所有物质一起称作培养物；当滤纸条顔色变为黄色后，将培养物转接到新鮮的限制性培养基内，接种量为5%(体积百分比)，在与第O代相同的条件下进行培养，至滤纸条顔色变为黄色后，再进行转接传代，如此培养数代。在上述传代培养过程中，每代都检测秸杆的分解率，检测时间为从接种开始计起第I天，从第5天开始检测分解率。在上述传代培养过程中，每代都检测培养物中菌群的16S rDNA组成是否稳定，从而检测培养物中菌种组成是否稳定，检测时间为从接种开始计起第I天(接种当天记作第I天)，第5天检测16S rDNA。上述培养及检测过程，均设对照组，对照组中除三角瓶中不添加任何秸杆外，其余均与实验组相同。对照组的目的在于消除秸杆分解率计算时菌体及培养基的影响。当秸杆分解率高且传代间稳定、传代间菌种组成稳定时，相应代的培养物中即含有所需分解木质纤维素的菌群。如果菌群稳定，降解率就会稳定。限制性培养基为蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基，由终浓度为5g/L的蛋白胨、终浓度为lg/L的酵母提取物、终浓度为5g/L的NaCl、终浓度为lg/L的K2HPO4、终浓度为O. 35g/L的MgSO4 · 7H20和终浓度为3g/L的CaCO3组成，所述终浓度为各物质在培养基中的浓度。3、秸杆分解率的测量方法及菌种组成的检测方法( I)秸杆分解率的检测方法分别称量分解前和分解后的秸杆重量，按照下述公式计算得到分解率分解率=(分解前的稻杆重量-分解后的稻杆重量)/分解前的稻杆重量。分解前的秸杆重量为O. 15g ;分解后的秸杆重量的计算及称量方法将培养物用已知重量的滤纸过滤，将滤渣在105°C下烘干后称重；滤前滤纸的重量公式是(秸杆分解前原始重量+滤纸重量)-(分解后秸杆+滤纸重量)。(2)菌种组成的检测方法原理PCR扩增各代复合菌群的16S rDNA,再进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，比较各代复合菌群的16S rDNA条带，分析各代间菌种组成的变化，当各代之间的PCR-DGGE条带趋于稳定时，证明复合菌群组成稳定。I)用氯仿-苯酚抽提法提取各代复合菌群总DNA ；2)以总DNA为模板，用如下引物357F/517R进行PCR扩增357F GC,GC cIampb 5，-CCTACGGGAGGCAGCAG-3，(GC-clamp 序列为 5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3，)；517R : 5，-GTGCCAGC (A/C)GCCGCGG-3，。PCR反应条件为首先，95 °C预变性lOmin，然后，93 °C变性lmin，48 °C退火lmin30sec，72°C延伸lmin，共30个循环，最后，72°C延伸lmin，4°C维持。3)将步骤2)得到的各代PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，比较各代PCR扩增产物的图谱(即PCR-DGGE条带)，当各代之间的PCR-DGGE条带趋于稳定时，证明复
合菌群组成稳定。结果表明，从第O代培养开始，培养至30代，秸杆分解率趋于稳定且高，分解率为70%以上；培养至20代，复合菌群组成稳定；培养至20代，得到组成稳定、秸杆分解率高且稳定的复合菌群。 ニ、筛选的复合菌群对木质纤维素的降解I、复合菌群降解水稻秸杆将第30代的培养物与水稻稻杆和培养基混合(培养物、水稻稻杆和培养基的配比为5ml培养物lg水稻秸杆50ml培养基)，在室温(34°C )、150rpm/min条件下震荡培养条件下发酵6-15天。然后测秸杆中纤维素和半纤维素的含量。发酵所用培养基为改良的PCS培养基，其组成为蛋白胨5g，酵母提取物lg，NaC15g，K2HPO4Ig, MgSO4 · 7H20 O. 35g，CaC033g，溶解在 IL 水中。秸杆中纤维素和半纤维素的含量測定步骤(I)将分解前后的水稻秸杆样品分别称取Ig (相同样品设置3个重复)，装在醋酸纤维滤通中，安装在SOKURE玻璃萃取管内，用こ醇ーこ醚(I I，体积比)混合液处理24小时，干燥后，得到残留固体，接着用水环流2小时，干燥后称得的重量为Ml。(2)将(I)得到的残留物用O. 65mol/L HCl环流2小时，干燥后，称得的重量为M2。(3)将(2)得到的残留物用15M H2SO4浸泡2小时后，用O. 42M H2SO4环流5小时，干燥后称得的重量为M3。(4)分解后秸杆重量称量方法减重法。计算公式半纤维素的重量=M1-M2 ;纤维素的重量=M2-M3 ;半纤维素分解率=(分解前半纤维素重量-分解后半纤维素重量)/ (分解前秸杆 重量-分解后秸杆重量);纤维素分解率=(分解前纤维素重量-分解后纤维素重量)/ (分解前秸杆重量-分解后稻杆重量)。实施例2、用于制备秸杆发酵饲料的复合菌群的筛选一、复合菌群的筛选I、菌源
取东北水稻产区的的秸杆作为菌源。2、复合菌群的限制性培养和筛选实验组取O. 5g菌源秸杆接入装有IOml限制性培养基的三角瓶中，厌氧培养于5°C冰箱中，培养IOd (记作第O代培养)，得到培养物(将三角瓶中的所有物质一起称作培养物)；然后取15 μ I培养物接入新鲜的限制性培养基中，5°C、厌氧培养4d (记作第I代培养);再将培养物转接入新鮮的限制性培养基，在与第I代培养相同的条件下进行培养，依此连续传代培养数代。在上述传代培养过程中，每代都检测培养物的pH值，。在上述传代培养过程中，每代都检测乳酸的产率，检测时间为从接种开始时计起培养48h。在上述传代培养过程中，每代都检测培养物中菌群的16S rDNA组成是否稳定，从而检测培养物中菌种组成是否稳定，检测时间为从接种开始计起第3天(接种当天记作第I天)。当乳酸产率高且传代间稳定、传代间菌种组成稳定、pH下降迅速(即12小时可将PH从6. 4降至3. 8)时，相应代的培养物中即含有用于制备秸杆发酵饲料的菌群。所用的限制性培养基为，R-MRS培养基，其组成如表I所示。R-MRS的意思就是加了稻草做底物的MRS培养基。表I、MRS培养基的组成
权利要求
1.一种筛选功能菌群的方法，由如下步骤组成 1)选取含有功能菌群的基质； 2)将所述基质接种于限制性培养基中进行培养，再传代培养； 3)建立评价所述功能菌群功能的指标；在每代培养过程中检测所述指标和检测所述功能菌群中菌种组成是否稳定； 4)若在某代培养过程中，所述指标符合对所述功能菌群的功能要求，且所述菌种组成稳定，则所述某代培养过程中得到所述功能菌群； 所述限制性培养基为所述功能菌群在其中生长、且不属于所述功能菌群的菌不能在其中生长的培养基。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述培养的条件与所述功能菌群在所述基质中生存的条件相同。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述功能菌群为分解木质纤维素的菌群。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述基质为秸杆柴垛腐烂的垛底、常年堆积的秸杆或常年堆积的树叶。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述限制性培养基由终浓度为5g/L的蛋白胨、终浓度为lg/L的酵母提取物、终浓度为5g/L的NaCl、终浓度为lg/L的K2HPO4,终浓度为O. 35g/L的MgSO4 ·7Η20、终浓度为3g/L的CaCO3和终浓度为O. lg/L的秸杆组成；所述终浓度为各物质在所述限制性培养基中的浓度。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述评价所述功能菌群功能的指标为秸杆分解率；所述指标符合对所述功能菌群的功能要求为秸杆分解率在所述传代培养的各代间稳定。
7.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述功能菌群为用于制备秸杆发酵饲料的菌群。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述基质为农作物秸杆、农作物赖以生长的土壤或农作物秸杆与农作物赖以生长的土壌的混合物；所述培养基为R-MRS培养基。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述评价所述功能菌群功能的指标为乳酸产率和PH值下降速度；所述指标符合对所述功能菌群的功能要求为所述乳酸产率在所述传代培养的各代间稳定，和所述PH值下降速度为12小时内pH从6. 4降至3. 8。
10.根据权利要求3-9中任一所述的方法，其特征在于所述检测所述功能菌群中菌种组成是否稳定的方法为在所述传代培养过程中，PCR扩增每代培养中的所述功能菌群的16SrDNA基因，得到各代的PCR扩增产物，比较各代的PCR扩增产物的图谱，若图谱稳定不变，则所述功能菌群中菌种组成稳定。
全文摘要
本发明公开了一种筛选功能菌群的方法。该方法由如下步骤组成1)选取含有功能菌群的基质；2)将所述基质接种于限制性培养基中进行培养，再传代培养；3)建立评价所述功能菌群功能的指标；在每代培养过程中检测所述指标和检测所述功能菌群中菌种组成是否稳定；4)若在某代培养过程中，所述指标符合对所述功能菌群的功能要求，且所述菌种组成稳定，则所述某代培养过程中得到所述功能菌群。本发明方法得到的功能菌群能够继续保持各种菌间的协同作用，组成稳定，功能强大，不会因为从自然界的分离而削弱作用力；另外，本发明方法操作简单、成本低廉，省时省力。因此，本发明方法在功能菌的筛选领域将会有广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102703321SQ20121017748
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者崔宗均, 王小芬 申请人:中国农业大学