专利名称：基于凝胶的多聚酶链式反应试剂保存方法及反应试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生化试剂组合物的保存方法技术领域，具体涉及ー种基于凝胶的多聚酶链反应试剂保存方法及反应试剂。
背景技术：
在过去的20年里，以多聚酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)为代表的核酸扩增技术得到了迅猛的发展和应用。由于PCR技术方便快捷、可在短时间内大量扩增目标核酸片段，所以该技术在基因克隆与重组表达、生物物种鉴别与分类、物种起源与进化、流行病病原检测和法医鉴定等领域得到了广泛的应用。虽然PCR技木本身优势明显，但基于该技术的产品在大規模应用过程中却面临ー些问题的困扰，其中最为突出的是产品需要低温冷冻保存和运输。作为核酸扩增技术的ー种，PCR扩增需要由具有生物活性的酶的參与，而酶生物活性的长期保持需要低温冷冻条件，同时PCR反应所需的寡聚核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和反应缓冲液等均需在冷冻条件下贮存，并且反复冻融会使这些成份失效，所以基于PCR扩增技术的产品要求在低温冷冻条件进行运输和保存，这ー方面增加了运输成本，另ー方面也限制了这些产品在不具备低温保存条件的环境或地区的应用。对于大規模生产、商品化的基于PCR扩增技术的产品，为了保证产品的一致性、稳定性和可靠性，也要求尽可能把各种反应试剂一次性添加和分装，并使产品在贮存和运输过程中具备尽可能长的保质期限。因此，发明一种能够方便有效保存PCR反应试剂混合物的方法具有重要的价值。发明专利“聚合酶链式反应混合物的保存方法(ZL 0011250. 4)”公开了ー种利用核酸真空浓缩仪在低温条件下干燥PCR反应试剂混合物来实现PCR反应试剂混合物长期保存的方法，但这种方法需要专门的核酸真空浓缩仪或真空冷冻干燥仪等复杂的设备，还需要消耗大量的能源，并不是ー种十分经济的方法。发明专利“含高浓度甘油的PCR和RT-PCR全预混试剂(ZL 03117011. O)”公开了ー种利用添加30-65% (v/v)甘油实现PCR试剂低温长期保存的方法，但该方法无法用于PCR试剂的常温长期保存。因此有必要提供一种能使PCR试剂在常温下长期保存的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于凝胶的多聚酶链反应试剂保存方法及反应试剂，以弥补现有技术的不足。本发明的ー个方面是提供一种在多聚酶链反应试剂中添加能形成凝胶的物质并形成凝胶从而使PCR反应试剂混合物在常温或室温长期保存的方法。本发明的另ー个方面是提供一种采用上述方法制作的PCR反应试剂，以及包含有该反应试剂的试剂盒。本发明的基于凝胶的多聚酶链反应试剂保存方法，是将ー种或几种多聚酶链反应液的组分包埋在凝胶内进行保存。上述的凝胶，其熔点低于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度。
上述的凝胶，还包括有熔点高于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度的凝胶，这种高熔点的凝胶必须与熔点低于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度的凝胶同时添カロ，添加比例不高于熔点低于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度的凝胶质量的10%。上述的多聚酶链反应液的组分为用于多聚酶链反应的聚合酶。上述的多聚酶链反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、多聚酶链反应聚合酶的反应缓冲液中的任ー种或几种。上述的用于多聚酶链反应的聚合酶为DNA聚合酶。上述的DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。本发明的保存方法，ー种操作步骤如下首先将可形成凝胶的物质添加到多聚酶 链反应液的组分中，然后在低于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度下将凝胶熔解，最后冷却凝固凝胶进行保存。本发明的保存方法，另ー种操作步骤如下首先将可形成凝胶的物质与水或含水的溶剂加热使之溶解配成浓缩的母液，然后将浓缩的母液加入到多聚酶链反应液的组分中，最后让温度下降使混合物由液态凝固为固态或半固态的凝胶进行保存。上述的可形成凝胶的物质在多聚酶链反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比 g/ml 为 O. 01% 30%。上述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质。上述能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质为淀粉、糊精、凝结多糖(又称凝结胶、凝胶多糖、热凝胶、可得然胶、卡德兰)、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、亚麻籽胶、魔芋胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、低熔点琼脂糖、超低熔点琼脂糖、红藻胶、海藻酸(又称藻酸、褐藻酸、海藻素)、海藻酸盐(如海藻酸钠，又被称为海藻胶、褐藻胶或藻胶)、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶和阿拉伯胶中的任ー种或几种。上述的可以形成凝胶的物质为能形成凝胶的人工聚合物。上述能形成凝胶的人工聚合物为甲基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺中的任ー种或几种。上述的凝结多糖在多聚酶链反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 2% 3%，优选为 O. 5% 2. 5%ο上述的琼脂糖在多聚酶链反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为
O.3% 3. 5%，优选为 O. 5% 3%。本发明还涉及ー种可在常温下长期保存的多聚酶链反应试剂，该反应试剂是将除核酸模板外的ー种或几种多聚酶链反应液的组分包埋在凝胶内制备的。本发明还包括一种可以在常温保存和运输的多聚酶链反应试剂盒，该试剂盒包括有可在常温下长期保存的多聚酶链反应试剂，以及其它分子实验需要的组分。采用本发明方法处理后的多聚酶链反应试剂，可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。由于处理后的多聚酶链扩增反应试剂混合物呈固态状，可以很方便的进行航空运输，克服了此前反应试剂混合物呈液态较难利用航空方式进行长距离运输的难题。同时本发明的方法和试剂盒具有エ艺简单、成本低廉的特点，采用本发明方法处理后的多聚酶链反应试剂混合物及试剂盒在便利的贮存条件下(常温或室温等温度条件)具有活性稳定持久的优点，这在大大降低多聚酶链反应试剂的贮运成本的同时，还为多聚酶链反应的实际操作带来极大的便利。该发明必将有力促进多聚酶链反应技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于多聚酶链反应技术的诊断或检测试剂产品的大規模推广应用。
具体实施例方式在目前的分子实验、检测操作中，若是直接将PCR反应试剂(即多聚酶链反应液的组分)如引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、DNA聚合酶、DNA聚合酶的反应缓冲液(不同类型的PCR反应需要不同的反应试剂)等的混合物保存在常温或者室温条件下，通常情况下f 2天后这些反应试剂混合物就失去了对目的核酸的扩增能力。研究发现，在常温或室温的条件下，PCR反应试剂混合物中最容易失去反应活性的是DNA聚合酶，而这些聚合酶丧失活性的主要原因是由于长时间保存或温度过高或温度变化导致聚合酶活性中心維持高级结
构的氢键、离子键、ニ硫键等分子作用力受到破坏所致；在常温或室温条件下，多聚酶链反应液(即PCR反应试剂混合物)中的寡聚核苷酸引物、dNTP也会很快降解，无法參与基因扩增。申请人在长期的研究中发现，在PCR反应试剂混合物中添加O. 019T30%(W/V，即重量体积比)可以形成凝胶的物质，加热至合适的温度使凝胶分子熔解(或熔解)，然后使反应试剂混合物温度下降，混合物可由液态变为固态(或半固态)的凝胶，聚合酶分子就会被凝胶分子形成的三维网状结构所固定，聚合酶分子的空间结构(三维结构或高级结构)得以长期维持，聚合酶的活性即可长期保持。而且凝胶也会将PCR反应试剂混合物中的引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)以及聚合酶反应缓冲液中的各种成分固定，使其包埋在凝胶分子形成的微孔内，彼此间形成物理性的隔断，同时也隔绝空气，从而使PCR反应试剂混合物的各种成分得以长期稳定保存。本发明是通过在PCR反应试剂混合物中添加可以形成凝胶的物质并使反应试剂混合物形成凝胶，将反应试剂的成分包埋在凝胶内部的微孔内，使诸成分被固定、形成物理性的隔断来实现PCR反应试剂混合物的常温长期保存的。当需要使用添加了凝胶的PCR反应试剂混合物时，可在其中加入核酸模板按照PCR程序进行温度循环，当加热到一定温度时凝胶完全熔化成液态，PCR反应即可顺利进行。在较便利的贮存条件下(如常温或室温)和一定的贮存期内，上述添加凝胶后的PCR反应试剂混合物进行PCR反应所得的结果与用新鮮配制的PCR反应混合物所得到的结果完全相同。因不同类型的PCR所需的最适反应温度不同，所以不同类型的PCR反应试剂混合物需要添加不同种类、不同熔点的凝胶或其不同比例的混合物来实现基于凝胶固定的常温长期保存。实际使用中，应根据PCR所需要的最适温度选择在该温度下能够完全或部分熔解的凝胶以取得较佳保护及扩增效果；通常情况下，所选用的凝胶的熔点应低于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度，有时为了提高凝胶的强度，可以添加部分熔点高于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度的凝胶，但这种高熔点的凝胶必须与熔点低于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度的凝胶同时添加，且添加比例不高于熔点低于用于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度的凝胶的10%，如可利用“10%明胶+0. 1%结冷胶”的方式提高明胶的強度，或可利用“2. 0%琼脂糖+0. 2%聚丙烯酰胺”的方式提高琼脂糖凝胶的强度(上述百分比表示凝胶在多聚酶链反应液的组分中的添加浓度，为质量体积百分比g/ml)。上述凝胶是指溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接或自身分子吸水膨胀，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的液体的ー种特殊的分散体
系O通常选用的可以形成凝胶的物质的是指各种能形成凝胶的多糖类物质、明胶类物质，如淀粉、糊精、凝结多糖(又称凝结胶、凝胶多糖、热凝胶、可得然胶、卡德兰)、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、亚麻籽胶、魔芋胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、低熔点琼脂糖、红藻胶、海藻酸(又称藻酸、褐藻酸、海藻素)、海藻酸盐(如海藻酸钠，又被称为海藻胶、褐藻胶或藻胶；又如海藻酸等)、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶和阿拉伯胶等；也可选用其他能形成凝胶的物质，如甲基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺等。实际使用中，应以热可逆的凝胶为主，非热可逆的凝胶可少量添加以提高凝胶的熔点、增强凝胶的强度。将PCR反应试剂混合物保存于常温或者室温，Γ2天后这些反应试剂混合物对目的核酸的扩增能力就基本完全丧失了。实验结果表明，采用本发明的方法处理后的PCR反应试剂的混合物可以在常温或室温条件下存放2个月或以上而不会失去正常反应活性，在较低的温度条件下(如4°C或以下)存放6个月仍具有正常的反应活性。
以下通过实施例对本发明作进ー步说明。实施例I :PCR反应试剂混合物添加凝胶后的保存效果分析I. PCR反应试剂混合物添加不同浓度和不同种类凝胶进行保存将除核酸模板以外的各种PCR反应试剂的混合物6048 μ L(包括PCR引物F和引物R 各 O. 4 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM, KCl 50mM, Tris/HCl (pH 9. 0) IOmM, MgCl2
I.5mM, l%Triton X-100，Taq DNA 聚合酶 630U)按每管 432 μ L 分装于 14 个 I. 5mL 的离心管中，按表I第I列(共14行)所示的浓度和种类向每个I. 5mL的离心管中加入可形成凝胶的物质并混匀，然后将I. 5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于5(T65°C保温5分钟(低于Taq DNA聚合酶的灭活温度100°C )，使凝胶充分溶解，再将每个I. 5mL离心管中的混合物按24 μ L的量分装于18个O. 2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的O. 2mL的离心管分别置于4°C、20°C (常温)、37°C条件下保存(每个温度条件下保存6个装有混合物的O. 2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的O. 2mL的离心管作为重复)。2. PCR反应试剂混合物添加两种及两种以上凝胶进行保存将除核酸模板以外的各种PCR反应试剂的混合物6048 μ L (包括PCR引物F和引物 R 各 O. 4 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM, KCl 50mM, Tris/HCl (pH 9. 0) IOmM,MgCl2L 5mM, l%Triton X-100, Taq DNA 聚合酶 630U)按每管 432 μ L 分装于 14 个 I. 5mL 的离心管中，按表2第I列(共14行)所示的浓度和种类向每个I. 5mL的离心管中加入凝胶并混匀，然后将I. 5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于5(T63°C保温5分钟，使凝胶充分溶解，再将每个I. 5mL离心管中的混合物按24 μ L的量分装于18个O. 2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的O. 2mL的离心管分别置于4°C、20°C和37°C条件下保存(每个温度条件下保存6个装有混合物的O. 2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的O. 2mL的离心管作为重复)。3. PCR反应试剂混合物的保存和有效性检验保存于4°C装有反应试剂混合物的O. 2mL的离心管分别在贮存期满2个月、4个月和6个月时进行抽样检验，保存于20°C的装有反应试剂混合物的O. 2mL的离心管分别在贮存期满I个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37°C的装有反应试剂混合物的
O.2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下I)依据上述9个贮存时间段，共需进行9批次、每批次56个的PCR反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的对虾白班综合征病毒(White spot syndromevirus, WSSV)的核酸(30ng/ μ L) 56 μ L等量分装于56个装有混合有凝胶的PCR反应试剂混合物的O. 2mL的离心管中。同时，按照本实施例步骤I中的试剂比例配制新鮮的PCR反应液24μ L，添加变性后的WSSV核酸(30ng/l·! L) I μ L，作为阳性对照。2)将上述离心管于放入PCR仪中进行PCR反应95°C保温5min，I个循环；95°C保温30sec，63°C保温30sec，72°C保温lmin，共35个循环；72°C保温5min，I个循环。PCR反应终止后，将上述部分阳性对照、对照和添加凝胶的反应体系扩增后的产物进行电泳检測，结果显示阳性对照有目的条带出现，实验设置的对照组(PCR反应试剂的混合物中不添加 任何凝胶直接在4° C、20°C和37° C条件下保存)均无扩增产物，添加不同浓度、不同种类凝胶的PCR反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表I和表2。添加不同浓度、不同种类凝胶的PCR反应试剂混合物保存后的检测结果(见表I和
2)表明保存时间为I个月、2个月时，在4°C和20°C条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天和20天时，在37°C条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性。表I.不同浓度、不同种类凝胶对PCR反应试剂混合物的保护效果
权利要求
1.一种基于凝胶的多聚酶链反应试剂保存方法，其特征在干，是将ー种或几种多聚酶链式反应液的组分包埋在凝胶内进行保存。
2.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的凝胶，其熔点低于用于多聚酶链式反应的聚合酶的灭活温度。
3.如权利要求2所述的保存方法，其特征在于所述的凝胶，还包括有熔点高于多聚酶链式反应的聚合酶的灭活温度的凝胶，且添加比例不高于熔点低于用于聚酶链式反应的聚合酶的灭活温度的凝胶质量的10%。
4.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的多聚酶链式反应液的组分为用于多聚酶链式反应的聚合酶。
5.如权利要求4所述的保存方法，其特征在于所述的多聚酶链式反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、多聚酶链式反应聚合酶反应缓冲液中的任ー种或几种。
6.如权利要求2-5任一项所述的保存方法，其特征在于所述的用于多聚酶链式反应的聚合酶为DNA聚合酶。
7.如权利要求6所述的保存方法，其特征在于所述的DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。
8.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于，操作步骤如下首先将可形成凝胶的物质添加到多聚酶链式反应液的组分中，然后在低于多聚酶链反应的聚合酶的灭活温度下将凝胶熔解，最后冷却凝固凝胶进行保存。
9.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于操作步骤如下首先将可形成凝胶的物质与含水的溶剂加热使之溶解配成浓缩的母液，然后将浓缩的母液加入到多聚酶链式反应液的组分中，最后让温度下降使混合物由液态凝固为固态或半固态的凝胶进行保存。
10.如权利要求8或9所述的保存方法，其特征在于所述的可形成凝胶的物质在多聚酶链式反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 01°/Γ30%。
11.如权利要求8或9所述的保存方法，其特征在于所述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质。
12.如权利要求11所述的保存方法，其特征在于所述的多糖类物质和/或明胶类物质为淀粉、糊精、凝结多糖、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、亚麻籽胶、魔芋胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、低熔点琼脂糖、超低熔点琼脂糖、红藻胶、海藻酸、海藻酸盐、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶、阿拉伯胶中的任ー种或几种。
13.如权利要求8或9所述的保存方法，其特征在于所述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的人工聚合物。
14.如权利要求13所述的保存方法，其特征在于所述的人工聚合物为甲基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺中的任ー种或几种。
15.如权利要求12所述的保存方法，其特征在于所述的凝结多糖在多聚酶链式反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 2°/Γ3%。
16.如权利要求12所述的保存方法，其特征在于所述的超低熔点琼脂糖在多聚酶链式反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 39Γ3. 5%。
17.一种多聚酶链反应试剂，其特征在于，所述的反应试剂是将除核酸模板外的ー种或几种多聚酶链式反应液的组分包埋在凝胶内制备的。
18.如权利要求17所述的反应试剂，其特征在于所述的多聚酶链式反应液为多聚酶链反应聚合酶、引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、多聚酶链反应聚合酶反应缓冲液中的任ー种或几种。
19.ー种多聚酶链反应试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含有权利要求17所述的多聚酶链反应试剂。
全文摘要
本发明涉及一种基于凝胶的多聚酶链反应试剂保存方法及反应试剂，是将一种或几种多聚酶链式反应液的组分包埋在凝胶内进行保存，其中凝胶的熔点低于用于多聚酶链反应扩增的聚合酶的灭活温度。另外本发明还包括可以常温保存和运输的反应试剂和试剂盒，采用本发明方法处理后的多聚酶链反应试剂，可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。由于处理后的多聚酶链扩增反应试剂混合物呈固态状，可以很方便的进行航空运输，克服了此前反应试剂混合物呈液态较难利用航空方式进行长距离运输的难题。
文档编号C12N15/10GK102703428SQ201210178919
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者刘庆慧, 刘莉, 宋晓玲, 张庆利, 杨冰, 黄倢 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所