预防或者治疗纤维化疾病的中药组合物及制备方法和用途的制作方法

专利名称：预防或者治疗纤维化疾病的中药组合物及制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，特别涉及一种预防或者治疗纤维化疾病的中药组合物及制备方法和用途。
背景技术：
组织纤维化是内外致病原引起组织损伤的共同后果，也是多种感染和非感染性炎症疾病的基本病理改变。组织纤维增生不仅见于各种慢性肺疾病、心血管疾病、慢性进行性肾病、肝硬化、慢性胰腺炎、系统性红斑狼疮以及黄斑变性等，而且能够影响肿瘤生长与转移、促进器官移植的慢性排斥反应发生。事实上，组织纤维化累及人体几乎所有器官和系统，是许多疾病致残、致死的主要原因，严重威胁人类健康。据美国有关统计资料证明，因各种疾病而致死的病人中，接近45%可以归于各种组织纤维增生疾病。长期以来，抗炎药，特别是糖皮质激素，是治疗肺纤维化的主要药物，然而，糖皮质激素的治疗不仅副作用大，效 果不确切，长期使用还可能加重肺纤维化的发展。纤维增生性疾病属于典型的由遗传、环境等多种因素參与的慢性复杂疾病，其发病机制是由多靶点失衡造成的，单靶点药物难以获得足够的治疗效果，并且毒副作用较大。对多种纤维化疾病模型的研究发现，纤维化疾病是ー类Th2免疫反应占优势的疾病，Th2免疫反应是维持机体及受损组织处于慢性炎症状态、促进组织发生纤维化的原凶。Th2细胞因子如IL-5、IL-13能促进和加重器官纤维化；相反，Thl细胞因子如干扰素Y则具有抗纤维化的作用。目前，组织纤维增生性疾病仍然没有针对性有效的治疗方案。因此，开发新的抗组织纤维化药物以提高患者生活品质和降低死亡率，是一件迫在眉睫的事。

发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对的现有技术缺乏有效的预防或治疗纤维化疾病的药物的不足，提供一种新的预防或者治疗纤维化疾病的中药组合物及制备方法和用途。本发明提供一种预防或者治疗纤维化疾病的中药组合物，其配方包括原料A和/或原料A的提取物；所述的原料A的提取物为水或こ醇水溶液的提取物；其中，所述的原料A 包括黄苗、黑木耳(Auricularia auricula (L. exHooke) Underw)、三七、以及灵芝 B ;所述的灵芝 B 为赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst.)和 / 或紫芝(Ganodermasinense Zhao, Xu et Zhangノ；白勺胃LAuricularia auricula (L. exHooke；Underw)、‘三七、以及灵芝B之间的重量比为9 30 9 30 Γ9 6 12。本发明中，所述的黄苗、黑木耳(Auriculariaauricula (L. exHooke) Underw)>三七、以及灵芝B之间的重量比较佳的为12:9:1 :6。需要说明的是，本发明中所说的原料A的重量比均以原料的重量计量，即若本发明中药组合物配方中使用的是原料A的提取物，在计算用量时也以其原料A的重量计量。本发明中，所述的黄芪、三七本领域技术人员均知，均为中国药典收录名称定义的中药材。本发明中，所述的赤芝(GanodermaLucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst.)、紫芝(Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang)为本领域常规所用药材，为中国药典收录,其中，所述的紫芝(Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang)的同物异名为紫芝(Ganodermajaponicum(Fr.)Lloyd)。本发明中，所述的原料A在直接使用吋，一般按本领域常规粉碎使用，较佳的使粒径大小过40目筛即可。本发明中，所述的原料A的提取物一般按本领域常规方法制得，较佳的按下述方法制得将原料A用3 10重量倍数的水或3 10重量倍数的70v/v% 95v/v%こ醇水溶液回流提取2 3次，每次提取I 3小时，合并提取液，过滤，浓缩，干燥，粉碎即可。其中，所述的原料A的提取物在制备时按本领域常规操作，既可以将原料A中各原料分别制备提取物后混合，也可以各原料混合后再制备提取物。其中，当将原料A中各原料分别制备提取物后混合时，黄芪的提取物的提取时间较佳的为1-2小时；黑木耳(Auricularia auricula (L. exHooke)Underw)的提取物的提取时间较佳的为I. 5 3小时；三七的提取物、以及灵芝B的提取物的提取时间分别较佳的为2^3小时。本发明中，所述的中药提取物较佳的还含有原料C和/或原料C的发酵培养物，所述的原料 C 为冬虫夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc)和 / 或隐孔菌(Crytoporusvolvatus (Peck. ノHubbara. )0其中，所述的冬虫夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc)的发酵培养物较佳的为蝙幅蛾被毛孢(Hiresutella hepiali Chen et Shen. (1985))的发酵培养物；蝙幅蛾被毛抱(Hiresutella hepiali Chen et Shen. (1985))的同种异名为中国被毛抱(Hiresutella sinensis X. J. Liu, Y. L. Guo. (1989))。其中，所述的隐孔菌(Crytoporus volvatus (Peck. )Hubbara.)的发酵培养物较佳的为中华隐孔菌(Crytoporus sinensis Sheng H. Wu&M. Zang)的发酵培养物。本发明中，所述的冬虫夏草发酵培养物为按本领域常规发酵方法将冬虫夏草发酵培养获得，较佳的由下述方法制得将冬虫夏草菌种接种至液体培养基中，之后进行通气培养得发酵培养物，干燥即可。所述的冬虫夏草菌种为按本领域常规方法经过ニ级或三级种子培养获得的菌种。其中，所述的ニ级种子培养是指依次经过斜面菌种培养、摇瓶种子培养、一级和ニ级种子罐培养。所述的三级级种子培养是指依次经过斜面菌种培养、摇瓶种子培养、一级、ニ级和三级种子罐培养。所述的培养的条件为本领域常规操作，较佳的为10°c 18°C、pH
6.O 7. 5。所述的斜面菌种培养、摇瓶种子培养、ー级、ニ级和三级种子罐培养的培养时间，较佳的分别为30 60天、10天、6天、6天、6天和6 12天。其中，所述的液体培养基为本领域常规使用，较佳的为重量百分比的碳源0.5% 5%，氮源0. 2% 5%、微量元素、维生素，补足余量的水；更佳的为重量百分比蚕蛹粉2. 0%,蛋白胨I. 5%，玉米粉I. 8%，蔗糖I. 6%，磷酸ニ氢钾0. 1%，硫酸镁0. 05%，其余为水分。其中，所述的通气按本领域常规操作，一般为通入无菌空气。 其中，所述的干燥为本领域常规操作，较佳的为喷雾干燥。所述的干燥可按本领域常规，直接将发酵培养物匀浆后干燥，也可以先过滤得菌丝体和发酵滤液(或经膜分离获得有效发酵滤液)之后分别干燥。本发明中，所述的隐孔菌发酵培养物为按本领域常规发酵方法将隐孔菌发酵培养获得，同前述冬虫夏草发酵培养物的制备方法，即较佳的由下述方法制得将隐孔菌菌种接种至液体培养基中，之后进行通气培养得发酵培养物，干燥即可。所述的隐孔菌菌种为按本领域常规方法经过ニ级或三级种子培养获得的菌种。其中，所述的ニ级种子培养、三级级种子培养如前所述。所述的培养的温度为本领域常规操作，较佳的为20°C 30°C。所述的斜面菌种培养、摇瓶种子培养、ー级、ニ级和三级种子罐培养的培养时间，较佳的分别为3 10天、6天、6天、6天、6天和I 10天。其中，所述的液体培养基、通气、干燥的操作同前述冬虫夏草发酵培养物制备操作条件。所述的液体培养基较佳的为重量百分含量葡萄糖O. 6%-3. 0%，麦芽糖I. 5%-1. 8%，玉米粉 0-0. 3%，蛋白胨 O. 1%-0. 5%,酵母粉 O. 8%-1%，KH2PO4 O. 1%，MgSO4 · 7H20 O. 05%,维生素B1 O. 05%-0. 1%，琼脂 0-2. 7%, pH 4. 5-5. 0，其余成分为水。 本发明中，所述的原料C和/或原料C的发酵培养物的用量较佳的为重量份数3 20，更佳的为3 9。所述的原料C的发酵培养物计量以原料C的发酵培养物重量计。本发明中，所述的灵芝B和/或灵芝B提取物还可以被替代为原料C和/或原料C的发酵培养物，获得本发明的中药提取物。本发明中，所述的中药组合物还可以含有药学上可接受的载体。本发明中，所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体。其中，稀释剂如淀粉、糖粉、糊精、微晶纤维素、甘露醇、乳糖和大豆油等；粘合剂如聚こ烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素等；崩解剂如羧甲基纤维素钠或低取代羟丙纤维素等；润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉等；稳定剂如羧甲基纤维素钠或环糊精等；防腐剂如对羟基苯甲酸こ酯或苯甲酸钠等。另外，还可以在该药物组合物中加入其他辅助剂如香味剂和/或甜味剂如蔗糖、果糖和天冬甜素等。该药物组合物的活性成分是治疗有效量的上述的本发明的提取物。该药物组合物可采用医学领域常规的方法，将所述的活性成分与药学上可接受的载体制成各种剂型。用于ロ服时，可将其通过常规方法包括混合、制粒、干燥、装胶囊或压片或分装成颗粒剂等制备成常规的固体制剂如片剂、胶囊、软胶囊、液体制剂、颗粒剂、煎膏剂、丸剤、悬浮齐U、分散剂或糖浆剂等。本发明的中药组合物较佳经ロ服途径应用，安全有效。所述的中药组合物的使用剂量根据患者的年龄和病情而定，常用的每日剂量约为O. OOOf 100g，优选O. 01 5(^,更优选O. I 20g,给药次数一天一次或数次。本发明还提供前述中药组合物的制备方法为按配方，将各成分均匀混合即可。本发明还提供前述的中药提取物在制备预防或治疗纤维化疾病的药物中的用途。本发明中，所述的纤维化疾病一般包括心脏纤维化疾病、肺脏纤维化疾病、肾脏纤维化疾病或肝脏纤维化疾病等在内的具有纤维增生性特征的疾病。其中，所述的肺纤维化疾病通常由慢性阻塞性肺病(C0PD)、特发性肺纤维化或间质性肺炎等疾病引起或伴发。本发明中药组合物能有效治疗经典药物性导致肺纤维化疾病模型(博来霉素模型)。其中，所述的心脏纤维化疾病通常由高血压心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病(又称冠心病)、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、心律失常(特别是心房纤颤或室性心动过速)或慢性心衰等疾病引起或伴发。本发明中药组合物能有效治疗经典药物性导致心脏纤维化疾病模型(阿霉素模型)。其中，所述的肝纤维化疾病(肝硬化)通常由病毒性肝炎、酒精性肝炎或脂肪肝等疾病引起或伴发。所述的病毒性肝炎通常是指甲肝、こ肝或丙肝。其中，所述的肾纤维化疾病包括终末期肾病(各种原因引起的肾衰)，通常由可导致肾衰的肾小管、肾小球等疾病引起或伴发。本发明中药组合物能有效治疗经典梗阻性肾病导致肾脏纤维化疾病模型(单侧输尿管结扎(UUO)模型)。在预防或治疗纤维化疾病时，本发明的中药组合物可以单独使用或者与其他没有拮抗作用的药物联合使用。本发明中，为方便表达及描述，在


及具体实施方式
中将本发明的中药组合物以缩写CFZ代替。本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。本发明的积极进步效果在于I、本发明的中药组合物可以同时作用于多个靶点，降低单靶点药物引起的副作用，各成分有协同作用药效治疗效果超过单组份药效的总和。2、本发明中药组合物在预防和逆转肺纤维化的应用中，对于小鼠纤维化疾病，包括心脏纤维化疾病、肺脏纤维化疾病、肾脏纤维化疾病或肝脏纤维化疾病等在内的具有纤维增生性特征的疾病具有明显的预防或治疗效果；能显著抑制博莱霉素引起的肺纤维化降低肺纤维化小鼠的死亡率，降低肺纤维化小鼠的肺重指数；降低肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸、胶原的含量，并降低与肺纤维化相关的α -肌动蛋白(α -SM)的表达，減少肺纤维化小鼠肺泡灌洗液中多种炎性细胞的数量；增加肺脏中抑纤维化的Thl细胞因子的分泌，減少促纤维化的Th2细胞因子的分泌，调节纤维化肺脏的抑制性免疫微环境。3、本发明的中药组合物在预防和逆转阿霉素(DOX)所致扩心病心室异常重构及心肌组织纤维化的应用中，能显著改善阿霉素所致扩心病心室异常重构及心肌组织纤维化；可以显著抑制左心室舒张期前壁厚度、后壁厚度和室间隔厚度的减小，显著抑制舒张期左室内径的増加，显著改善体现心脏收缩和舒张功能的各项指标，表现为心脏射血分数、左心室短轴缩短率、左心室收缩压上升最大速率、左心室舒张压下降最大速率増加，降低心肌中胶原的含量，并降低与纤维化相关的a -SMA的表达，抗心脏组织纤维化表现为与改变组织Thl/Th2免疫极化方向，增强抗组织纤维化因子的表达，抑制促组织纤维化因子表达关系密切。4、本发明的中药组合物在预防和逆转单侧输尿管结扎(UUO)诱导的肾纤维化病变的应用中，能够减轻单侧输尿管结扎所诱导的小鼠肾纤维化，表现为減少肾组织的胶原沉积，上调上皮细胞特征性蛋白E-钙粘素表达，減少活化的成纤维细胞标志性蛋白a -SMA表达。

图I为预防性给予样品药物降低博莱霉素引起肺纤维化小鼠的死亡率随时间变、化关系图；其中，博来霉素造模后第7天开始给予中药组合物或干扰素-Y，CFZ低为低剂量组(lg/kg/day)，CFZ中为中剂量组(2g/kg/day)，CFZ高为高剂量组(4g/kg/day)；##P<0. Olvs假手术组；*P〈0. 05vs模型组。图2为预防性给予样品药物降低肺纤维化小鼠的肺脏胶原沉积Masson染色图，及绝对胶原面积比较图；其中，博来霉素造模后第7天开始给予中药组合物或干扰素Y，CFZ低为低剂量组(lg/kg/day)，CFZ中为中剂量组(2g/kg/day)，CFZ高为高剂量组(4g/kg/day) ；###P<0. OOlvs 假手术组;*Ρ〈0· 05，_Ρ〈0· OOlvs 模型组。图3为预防性给予样品药物对肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量的影响图；其中，博来霉素造模后第7天开始给予中药组合物或干扰素Y ;CFZ低为低剂量组(lg/kg/day), CFZ中为中剂量组(2g/kg/day)，CFZ高为高剂量组(4g/kg/day) ；##P<0. Olvs假手术组;*Ρ〈0· 05，**Ρ〈0· Olvs 模型组。 图4为预防性给予样品药物对小鼠肺组织α-SMA表达水平的影响图；其中，博来霉素造模后第7天开始给予中药组合物或干扰素Y，CFZ低为低剂量组(lg/kg/day)，CFZ中为中剂量组(2g/kg/day)，CFZ高为高剂量组(4g/kg/day) ；##P<0. Olvs假手术组，*P〈0. 05vs 模型组。图5为预防性给予样品药物对肺纤维化小鼠的肺脏炎症影响的HE染色图，及炎症对比图；其中，博来霉素造模后第7天开始给予中药组合物或干扰素Y，CFZ低为低剂量组(lg/kg/day)，CFZ中为中剂量组(2g/kg/day)，CFZ高为高剂量组(4g/kg/day)；###PくO. OOlvs 假手术组；**Ρ〈0· 01，***Ρ〈0· OOlvs 模型组。图6为预防性给予样品药物对肺纤维化小鼠肺泡灌洗液中多种炎性细胞影响的数量对比图；其中，博来霉素造模后第7天开始给予中药组合物或干扰素Y，CFZ低为低剂量组(lg/kg/day)，CFZ中为中剂量组(2g/kg/day)，CFZ高为高剂量组(4g/kg/day)；##PくO. 01，###PくO. OOlvs 假手术组;*P〈0. 05vs 模型组。图7为预防性给予样品药物对肺纤维化小鼠肺组织Thl、Th2细胞因子分泌的调节作用(ELISA)含量对比图；其中，博来霉素造模后第7天开始给予中药组合物或干扰素Y，CFZ低为低剂量组(lg/kg/day)，CFZ中为中剂量组(2g/kg/day)，CFZ高为高剂量组(4g/kg/day) ;##PくO. 01，###PくO. OOlvs 假手术组;*Ρ〈0· 05，**Ρ〈0· Olvs 模型组。图8为治疗性给予样品药物对博莱霉素引起肺纤维化小鼠的死亡率随时间变化关系图；其中，博来霉素造模后第14天开始给予中药组合物或干扰素Y，CFZ中Af为中剂量治疗组(2g/kg/day)，CFZ高Af为高剂量治疗组(4g/kg/day) ；##P<0. Olvs假手术组；*P〈0. 05vs 模型组。图9为治疗性给予样品药物对肺纤维化小鼠作用的肺脏胶原沉积Masson染色图，及绝对胶原面积比较图；其中，博来霉素造模后第14天开始给予中药组合物或干扰素Y，CFZ中Af为中剂量治疗组(2g/kg/day)，CFZ高Af为高剂量治疗组(4g/kg/day)；###PくO. OOlvs 假手术组，**Ρ〈0· 01，***Ρ〈0· OOlvs 模型组。图10为治疗性给予样品药物对肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量的影响图；其中，博来霉素造模后第14天开始给予中药组合物或干扰素Y，CFZ中Af为中剂量治疗组(2g/kg/day), CFZ 高 Af 为高剂量治疗组(4g/kg/day) ;##PくO. Olvs 假手术组，**P〈0. Olvs模型组。
图11为预防性给予样品药物对阿霉素所致扩心病小鼠心室扩张的影响图，代表性心脏切片(图A左)和超声心动图(图A右)，左心室超声心动图參数(图B、C、D和E)，左心室舒张期前壁厚度(LVAWd)、后壁厚度(LVPWd)、室间隔厚度(IVSd)及舒张期左室内径(LVDd) ；#P<0. 05，##PくO. Olvs 正常组;*P〈0. 05vs 模型组。图12为预防性给予样品药物对阿霉素致扩心病小鼠心功能的影响图；CFZ对心脏射血分数(EF)、左心室短轴缩短率(FS)的影响(图A和B)，CFZ对左心室收缩压上升最大速率(+dP/dtmax)、左心室舒张压下降最大速率(-dP/dtmax)、心率(HR)、平均动脉压(MAP)等血流动力学指标的影响(图C-F) ;#PくO. 05，##P<0. Olvs正常组;*P〈0. 05，*Ρ〈0· Olvs模型组。图13为预防性给予样品药物对阿霉素致扩心病小鼠心脏组织纤维化影响图；心肌组织切片HE染色(图Α)，心肌组织切片Masson’ s染色分析心脏组织纤维化(图B和D);免疫组化检测a -SMA表达(图C和Ε) ；##P<0. Olvs正常组，*P〈0. 05vs模型组。 图14为预防性给予样品药物对阿霉素致扩心病小鼠心脏Thl/Th2平衡的影响图；CFZ抑制转化生长因子-β (TGF-β )表达(图A和C)，CFZ促进干扰素Y表达(图B和D);CFZ 增加干扰素 Y/转化生长因子 β 比值(IFNi/TGF-β)(图 Ε);##ρ〈0· 01，###ρ〈0· OOlvs正常组，**ρ〈0· 01, ***ρ〈0· OOlvs 模型组。图15为预防性给予样品药物对阿霉素致扩心病小鼠心脏组织氧化应激反应影响图；超氧化物歧化酶(SOD)检测(图Α)，丙ニ醛(MDA)检测(图B) ；##p<0. Olvs正常组，**ρ〈0· 05, ***ρ〈0· Olvs 模型组。图16为预防性给予样品药物对单侧输尿管结扎致小鼠肾纤维化影响图，肾组织切片Masson’s染色和a -SMA染色(图Α)，肾小管损伤评分(图B)，肾纤维化评分(图C)，小鼠肾外观(图D)，a-SMA半定量评价(图Ε)，蛋白质印迹检测a-SMA表达(图F) ;#ρ〈0. 05，##ρくO. 01，###ρくO. Olvs 假手术组，*ρ〈0· 05，**ρ〈0· 01，_ρ〈0· OOlvs 模型组。图17为预防性给予样品药物对基质金属蛋白酶(MMPs) /基质金属蛋白酶抑制物(HMPs)平衡影响图；代表性RT-PCR结果(图Α)，前胶原I、a-SMA、基质金属蛋白酶抑制物I (TIMPl)和基质金属蛋白酶(ΜΜΡ2)的表达和分析(图B-E), MMPs/TIMPs比值(图F)；#pくO. 05，##pくO. 01，###PくO. OOlvs 假手术组;*p〈0. 05vs 模型。图18为治疗性给予样品药物对单侧输尿管结扎致小鼠肾纤维化影像图(14天)，肾组织切片Masson’s染色图(放大100倍，图A，放大400倍，图B)，肾组织切片以抗a -SMA抗体染色观察激活的成肌纤维细胞(图C)和以E-钙粘素染色观察肾上皮细胞(图D)，CFZ减少肾胶原面积(图Ε)，蛋白质印迹检测a-SMA和E-钙粘素表达(图F) ;CFZ高为高剂量给药组(4g/kg/day), CFZ 低为低剂量给药组(lg/kg/day), ##pくO. 01, ###pくO. Olvs 假手术组;**ρ〈0· 01, ***ρ〈0· OOlvs 模型组。图19为治疗性给予样品药物对单侧输尿管结扎致小鼠肾纤维化影响图(21天)，其中，肾组织切片Masson’ s染色(放大100倍，图A，放大200倍，图B)，CFZ减少肾胶原面积和胶原面积比值(图C)，蛋白质印迹检测a -SMA和E-钙粘素表达(图D) ；CFZ高为高剂量给药组(4g/kg/day)，CFZ 低为低剂量给药组(lg/kg/day);#ρ〈0· 05，###p<0. Olvs 假手术组;*ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01, ***ρ〈0· OOlvs 模型组。图20为治疗性给予样品药物对单侧输尿管结扎致肾纤维化小鼠肾功能影响图；单侧输尿管结扎14天，结扎ー侧肾和对侧正常肾、脾重和体重分析(图A-F);单侧输尿管结扎21天，结扎ー侧肾和对侧正常肾、脾重和体重分析(图G-L)，肾功能以血清肌酐(图D、E)和尿素氮(图J、K)评价雨〈O. 01，###p<0. Olvs假手术组;*ρ〈0· 05，**ρ〈0· Olvs模型组。
具体实施例方式下面用实施例来进ー步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I配方黄苗1500g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)2000g,三七 500g, 灵芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. ) 1500g (质量比为 9 :12 :3 :9)。制备步骤(I)黑木耳提取物的制备黑木耳加10倍量水提取3次，每次提取I小时，合并提取液，滤过，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(2)黄芪、三七、灵芝分别粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(3)黑木耳提取物、黄芪、三七、灵芝混匀后，制粒，干燥，装胶囊，即得。实施例2配方黄苗75Og,黑木耳(Auriculariaauricula (L. exHooke)2500g,三七75Og,灵芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. )Karst. ))IOOOg (质量比为 9 30 9 :12)。制备步骤(I)黑木耳提取物的制备黑木耳加6倍量95%こ醇水溶液提取2次，每次I. 5小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(2)黄芪、三七、灵芝分别粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(3)黑木耳提取物、黄芪、三七和灵芝混匀，制粒，干燥，压片即得。实施例3配方黄苗1600g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1200g,三七 400g,灵芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. )) 1600g (质量比为 8 :6 :2 :8)。制备步骤(I)黄芪提取物的制备黄芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎成细粉，备用。(2)三七提取物的制备三七加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(3)黑木耳、灵芝粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。( 4 )黄芪、三七提取物、黑木耳、灵芝混匀，制粒，干燥，分装成颗粒剂，即得。实施例4配方黄苗1600g,黑木耳(Auricularia auricula (L. exHooke) 1600g,三七1200g,灵芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. )Karst. ))800g (质量比为 8 :8 :6 :4)。制备步骤(I)黄芪提取物的制备黄芪加5倍量水提取3次，每次提取2小时，合并提取液，滤过，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(2)黑木耳提取物的制备黑木耳加10倍量95%こ醇水溶液提取2次，每次3小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。
(3)三七、灵芝粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。( 4 )黄芪提取物、黑木耳提取物、三七、灵芝混匀，制粒，干燥，装胶囊，即得。实施例5配方黄苗1200g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)3000g,三七 IOOg,灵芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. )) 900g (质量比为 12 3 I :9)。制备步骤(I)黄芪提取物的制备黄芪加3倍量70V/V%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(2)黑木耳提取物的制备黑木耳加5倍量60v/v%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(3)灵芝粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。( 4 )黄芪提取物、黑木耳提取物、三七、灵芝混匀，制粒，干燥，分装成颗粒剂，即得。实施例6配方黄苗2500g,黑木耳(Auricularia auricula (L. exHooke)750g,三七 750g,灵芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. )) 750g (质量比为 10 3 3 :3)。制备步骤(I)黄芪提取物的制备黄芪加5倍量水提取3次，每次提取2小时，合并提取液，滤过，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(2)灵芝提取物的制备灵芝加10倍量95%こ醇水溶液提取2次，每次3小时，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(3)黑木耳、三七粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。( 4 )黄芪提取物、灵芝提取物、黑木耳、三七混匀，制粒，干燥，压片，即得。实施例7配方黄苗3000g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1200g,三七 IOOg,灵芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. )Karst. ))1200g (质量比为 30 12 I :12)。制备步骤(I)黄芪提取物的制备黄芪參加6倍量95%こ醇水溶液提取2次，每次I. 5小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(2)黑木耳、三七、灵芝分别粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(3)黄芪提取物、黑木耳、三七和灵芝混匀，制粒，干燥，压片即得。实施例8配方黄苗2000g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)2000g,三七 200g,灵芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. )) 400g (质量比为 10 :10 :1 :2)。制备步骤(I)黑木耳提取物的制备黑木耳加10倍量水提取3次，每次提取I小时，合并提取液，滤过，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。
(2)黄芪、三七、灵芝分别粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(3)黑木耳提取物、黄芪、三七和灵芝混匀后，制粒，干燥，装胶囊，即得。实施例9配方黄苗2400g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1800g,三七 200g,灵芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. )) 1200g (质量比为 12 :9 :1 :6)。制备步骤(I)黄芪提取物的制备黄芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。 (2)黑木耳提取物的制备黑木耳加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(3)灵芝提取物的制备灵芝加10倍量95%こ醇水溶液提取2次，每次3小时，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(4)三七粉碎成细粉，备用。(5)黄芪提取物、黑木耳提取物、三七和灵芝提取物混匀，制粒，干燥，分装成颗粒齐U，即得。实施例10配方黄苗1800g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1800g,三七 200g,灵芝(赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. )) 1200g (质量比为 9 :9 :1 :6)。制备步骤(I)黄芪提取物的制备黄芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(2)黑木耳提取物的制备黑木耳加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(3)三七、灵芝粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(4)黄芪提取物、黑木耳提取物、三七和灵芝细粉混匀，制粒，干燥，装胶囊，即得。实施例11配方黄苗2400g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1800g,三七 200g,冬虫夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc) 1200g (质量比为 12 :9 :1 :6)。制备步骤(I)黄芪提取物的制备黄芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(2)黑木耳提取物的制备黑木耳加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(3)三七、冬虫夏草粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(4)黄芪提取物、黑木耳提取物、三七和冬虫夏草细粉混匀，制粒，干燥，分装成颗粒剂，即得。实施例12配方黄苗2400g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1800g,三七 200g,隐孔菌(Crytoporus volvatus (Peck.) Hubbara. ) 1200g (质量比为 12 :9 :1 :6)。
制备步骤(I)黄芪提取物的制备黄芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(2)黑木耳提取物的制备黑木耳加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(3)三七、隐孔菌粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(4)黄芪提取物、黑木耳提取物、三七和隐孔菌细粉混匀，制粒，干燥，分装成颗粒 齐U，即得。实施例13配方黄苗2400g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1800g,三七 200g,冬虫夏草发酵培养物1200g (质量比为12 :9 :1 :6)。制备步骤(I)黄芪提取物的制备黄芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(2)黑木耳提取物的制备黑木耳加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(3)三七粉碎、过筛，得过40目筛的细粉，备用。(4)黄芪提取物、黑木耳提取物、三七和冬虫夏草发酵培养物混匀，制粒，干燥，分装成颗粒剂，即得。冬虫夏草菌发酵培养物的制备中国冬虫夏草无性代菌种蝙幅蛾被毛抱(Hiresutella hepiali Chen et Shen.(1985))(浙江赐富医药有限公司出售菌种)在液体培养基上发酵，获得发酵上清液、菌丝体及各种代谢物。发酵方法为依次斜面菌种培养、摇瓶种子培养、ー级、ニ级种子罐培养、液体发酵罐中通气培养，10 18°C，pH 6. 0 7· 5，分别培养50、10、6、6、10天。液体培养基(重量百分比，％)为蚕蛹粉2. 0，蛋白胨I. 5，玉米粉I. 8，蔗糖I. 6，磷酸ニ氢钾O. 1，硫酸镁O. 05，其余为水分，发酵过程中通入无菌空气。发酵完毕后固液分离，得到菌丝体和发酵液，发酵液再进行膜分离(超滤膜，膜孔径300)，收集膜截留液即得到富含有效成分的发酵滤液，发酵滤液浓缩后与菌丝体混合、匀浆、喷雾干燥，即得所述的冬虫夏草发酵培养物。实施例14配方黄苗2400g,黑木耳(Auricularia auricula(L. exHooke)1800g,三七 200g,隐孔菌发酵培养物1200g (质量比为12 :9 :1 :6)。制备步骤(I)黄芪提取物的制备黄芪加3倍量70%こ醇水溶液提取3次，每次3小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎成细粉，备用。(2)黑木耳提取物的制备黑木耳加5倍量60%こ醇水溶液提取3次，每次2小吋，滤过，合并滤液，浓缩干燥，粉碎成细粉，备用。(3)三七粉碎成细粉，备用。(4)黄芪提取物、黑木耳提取物、三七和隐孔菌发酵培养物混匀，制粒，干燥，分装成颗粒剂，即得。隐孔菌发酵培养物的制备(I)菌种活化将4°C条件下保存的隐孔菌菌种(Crytoporus sinensis Sheng
H.Wu&M. Zang)(浙江赐富医药有限公司出售菌种)，通过无菌操作移植到培养基中，在真菌常规培养温度下培养8天。培养基组分和重量百分含量为(％):葡萄糖O. 6，麦芽糖1.5，蛋白胨O. 1，酵母粉O. 8，KH2PO4 O. LMgSO4 · 7H20 O. 05，维生素 B1O. 07，琼脂 2. 7，pH 4. 8，其余成分为水。(2)摇瓶培养将上述活化的隐孔菌菌丝移入内装200mL下述培养液的500mL三角瓶中，在震荡频率为200epm、温度为2(T30°C条件下在摇床中震荡培养6天。培养液组分和质量(％)为葡萄糖O. 7，麦芽糖I. 6，蛋白胨O. 2，酵母粉1，KH2PO4 O. LMgSO4 · 7H20 O. 05，维生素 B1 O. I, pH 5.0，其余成分为水。(3)液体发酵培养在20L发酵罐中装入14L的下述培养液，用压差法移接相当于罐容量3%摇瓶培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1:0. Γ1. O (v/v/分钟)、叶轮搅拌速度为200rpm、罐压大于O. 05kg/cm2,温度20 30°C条件下发酵10天。培养液组分和重量百分含量(％)为葡萄糖3.0，麦芽糖I. 8，玉米粉O. 3，蛋白胨
O.5，酵母粉 1，KH2PO4 O. 1，MgSO4 · 7H20 O. 05，维生素 B10. 05，pH 4. 5，其余成分为水。(4)将上述发酵罐内的隐孔菌发酵产物采用常规过滤方法过滤得到菌丝体和发酵上清液；隐孔菌菌丝体滤饼在8(T90°C条件下烘干，粉碎、过筛，得到颗粒小于60目的隐孔菌菌粉；发酵上清液7(T80°C旋转蒸发浓缩至密度为I. 4克/毫升，再加热浓缩至稠膏状，加入上述所得菌粉，搅拌均匀，烘干、粉碎，过60目筛，即得所述隐孔菌发酵培养物。效果实施例I本发明的中药组合物在预防或治疗肺纤维化中的应用I、材料和方法I. I主要试剂本效果实施例所用的中药组合物是上述实施例9所得的产品，缩写为CFZ。实验所用博莱霉素(BLM)购自日本化药(日本化药株式会社)，批号191140。实验所用干扰素-Y(干扰素Y )购自上海克隆生物高技术有限公司，批号20090307。I. 2实验动物实验所用的SPF级C57BL/6小鼠(雄性，6 8周龄，16 18g)，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。I. 3肺纤维化动物模型制备雄性C57BL/6 (周龄6 8周)小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥钠(45mg/kg，i. p.)麻酔，气管内注射博莱霉素(5U/kg)。具体方案如下以尽量小的创伤切开颈部皮肤，在弯头眼科镊的协助下，暴露气管，使用微量进样器穿刺气管，向气管内注入约50 μ I博莱霉素，迅速地旋转并直立5分钟，以便使博莱霉素均匀地进入左右肺叶。整个操作在约60°C左右的手术操作台进行。假手术组(Sham)气管内注射等量的注射用生理盐水。I. 4实验分组(I) CFZ预防肺纤维化为研究本发明的中药组合物在预防肺纤维化的形成中的效果，将上述制备的动物模型在造模7天后分组给药，分组和给药情况如表I所示
表I肺纤维化动物模型在造模7天后分组给药的情况
权利要求
1.一种预防或者治疗纤维化疾病的中药组合物，其特征在于配方包括原料A和/或原料A的提取物；所述的原料A的提取物为水或こ醇水溶液的提取物；其中，所述的原料A包括黄苗、黑木耳(Auricularia auricula (L. exHooke) Underw)、三七、以及灵芝B ;所述的灵芝 B 为赤芝(Ganoderma Lucidum (Leyss. ex F r. ) Karst.)和 / 或紫芝(Ganodermasinense Zhao, Xu et Zhang；CAuricularia auricula (L. exHooke；Underw)、三七、以及灵芝B之间的重量比为9 30 9 30 Γ9 6 12。
2.如权利要求I所述的中药组合物，其特征在于所述的黄苗、黑木耳(Auriculariaauricula (L. exHooke)Underw)、三七、以及灵芝B之间的重量比为12 9 1 6 ;所述的原料A在直接使用时，粉碎使用，使粒径大小较佳的过40目筛。
3.如权利要求I所述的中药组合物，其特征在于所述的原料A的提取物按下述方法制得将原料A用3 10重量倍数的水或3 10重量倍数的70v/v% 95v/v%こ醇水溶液回流提取2 3次，每次提取I 3小时，合并提取液，过滤，浓缩，干燥，粉碎即可。
4.如权利要求3所述的中药组合物，其特征在于所述的原料A的提取物在制备时为将原料A中各原料分别制备提取物后混合，或者将各原料混合后再制备提取物； 当所述的原料A的提取物在制备时将原料A中各原料分别制备提取物后混合，黄芪的提取物的提取时间为1-2小时;黑木耳(Auricularia auricula (L. exHooke) Underw)的提取物的提取时间为I. 5 3小时；三七的提取物、以及灵芝B的提取物的提取时间分别为2^3小时。
5.如权利要求I所述的中药组合物，其特征在于所述的中药提取物还含有原料C和/或原料C的发酵培养物,所述的原料C为冬虫夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc)和 / 或隐孔菌(Crytoporus volvatus (Peck. ) Hubbara.)。
6.如权利要求I所述的中药组合物，其特征在于所述的灵芝B和/或灵芝B提取物被替代为原料C和/或原料C的发酵培养物,所述的原料C为冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk. ) Sacc)和 / 或隐孔菌(Crytoporus volvatus (Peck. ) Hubbara.)。
7.如权利要求5或6所述的中药组合物,其特征在于所述的冬虫夏草(Cordycepssinensis (Berk. ) Sacc)的发酵培养物为編幅蛾被毛抱(Hiresutella hepiali Chen etShen. (1985))的发酵培养物；所述的隐孔菌(Crytoporus volvatus (Peck. ) Hubbara.)的发酵培养物为中华隐孔菌(Crytoporus sinensis Sheng H. Wu&M. Zang)的发酵培养物。
8.如权利要求5或6所述的中药组合物，其特征在于所述的原料C和/或原料C的发酵培养物的用量为重量份数3 20，较佳的为重量份数3 9。
9.如权利要求7所述的中药组合物，其特征在于所述的原料C的发酵培养物由下述方法制得将原料C菌种接种至液体培养基中，之后进行通气培养得发酵培养物，干燥即可；所述的原料C菌种为按经过ニ级或三级种子培养获得的菌种。
10.如权利要求9所述的中药组合物，其特征在于所述的ニ级种子培养为依次经过斜面菌种培养、摇瓶种子培养、ー级和ニ级种子罐培养；所述的三级级种子培养为依次经过斜面菌种培养、摇瓶种子培养、ー级、ニ级和三级种子罐培养； 当所述的原料C为冬虫夏草时，所述的培养的条件为10°C 18°C、pH6. O 7. 5 ;所述的斜面菌种培养、摇瓶种子培养、ー级、ニ级和三级种子罐培养的培养时间分别为30 60天、10天、6天、6天、6天和6 12天；当所述的原料C为隐孔菌时，所述的培养的条件为20°C 30°C;所述的斜面菌种培养、摇瓶种子培养、ー级、ニ级和三级种子罐培养的培养时间分别为3 10天、6天、6天、6天、6天和I 10天。
11.如权利要求9所述的中药组合物，其特征在于所述的液体培养基为重量百分比蚕蛹粉2. 0%，蛋白胨I. 5%，玉米粉I. 8%，蔗糖I. 6%，磷酸ニ氢钾O. 1%，硫酸镁O. 05%,其余为水分； 当所述的原料C为隐孔菌时，所述的液体培养基较佳的为重量百分含量葡萄糖O. 6%-3. 0%,麦芽糖 I. 5%-1. 8%,玉米粉 0-0. 3%，蛋白胨 O. 1%_0· 5%,酵母粉 O. 8%_1%，KH2PO4O. 1%，MgSO4 · 7H20 O. 05%,维生素 B1 O. 05%-0. 1%，琼脂 0-2. 7%, pH 4. 5-5. 0，其余成分为水。
12.如权利要求f11任一项所述的中药组合物的制备方法，其特征在于按配方，将各成分均匀混合即可。
13.如权利要求f11任一项所述的中药组合物在制备预防或治疗纤维化疾病的药物 中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于所述的纤维化疾病包括心脏纤维化疾病、肺脏纤维化疾病、肾脏纤维化疾病或肝脏纤维化疾病。
全文摘要
本发明公开一种预防或者治疗纤维化疾病的中药组合物及制备方法和用途。该中药组合物配方包括原料A和/或原料A的提取物；所述的原料A的提取物为水或乙醇水溶液的提取物；其中，所述的原料A包括黄芪、黑木耳(Auricularia auricula(L.exHooke)Underw)、三七、以及灵芝B；所述的灵芝B为赤芝(Ganoderma Lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.)和/或紫芝(Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang)；所述的黄芪、黑木耳(Auricularia auricula(L.exHooke)Underw)、三七、以及灵芝B之间的重量比为9~30︰9~30︰1~9︰6~12。该制备方法为按配方将各成分均匀混合即可。该中药组合物能够有效预防或治疗纤维化疾病。
文档编号C12N1/14GK102716179SQ20121018366
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者严君, 何令帅, 崔冰, 胡卓伟, 陈黎 申请人:北京伟峰益民科技有限公司, 浙江赐富医药有限公司