一种检测和评价抗病毒感染活性的方法
【专利摘要】本发明涉及抗体工程和抗病毒医药领域，涉及一种快速有效的测定重组人抗乙型肝炎病毒抗体抗病毒功能的方法。本发明利用沉降性病毒复合物技术，建立了一种检测和评估分子抗病毒能力的新方法。该方法是通过检测受试分子在血清中诱导产生沉降性病原体复合物的能力，检测分子的抗病毒和抗感染能力；所述的病原体是病毒。利用该方法可以快速检测抗体和其它抗感染药物清除病毒和控制病毒感染的能力。本方法操作过程简单，结果重复性好，是对现有抗病毒药物功能性检测和评估方法的补充，该方法的建立为目前还没有有效的细胞和动物感染模型病毒的药物研发，提供了一种新的选择。本发明还涉及抗病毒感染活性的检测试剂、检测过程中出现的沉降性病原体复合物和上述检测方法的应用。
【专利说明】一种检测和评价抗病毒感染活性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗体工程和抗病毒医药领域，具体涉及一种快速有效的测定重组人抗乙型肝炎病毒抗体抗病毒功能的方法。
【背景技术】
[0002]人乙型肝炎病毒(human hepatitis B virus, HBV)感染是全球性的公共卫生问题，根据世界卫生组织((World Health Organization, WHO)的统计,全球范围内有超过20亿人曾感染过HBV，其中，3.5亿正遭受慢性HBV感染之苦(WH0，2000)。我国为乙型肝炎的高发区。2006年全国病毒性肝炎血清流行病学调查数据显示，在全部人群中乙肝表面抗原(HBsAg)的阳性率为7.18%。据此估计我国有9300万人为HBV携带者，其中，3000万例为慢性乙型肝炎患者。研究还显示，慢性的HBV感染又与肝硬化和肝癌的发病率和死亡率密切相关。
[0003]乙肝病毒是DNA病毒，具部分环状双链的DNA。基因组长度约为3.2kb，含有四个基本阅读框架，分别是编码核心蛋白(核心抗原)和e蛋白(e抗原)的C基因；编码大、中和小表面蛋白(表面抗原)的S基因；编码聚合酶的P基因和编码X蛋白的X基因。人乙型肝炎病毒具有种群和组织特异性，只感染人类的肝细胞。
[0004]乙肝病毒的感染始于病毒附着在肝细胞上，通过未知的机制，病毒外膜与细胞膜发生融合，病毒核衣壳被释放到细胞质中并解聚，病毒基因组转移到被感染细胞的细胞核内，在细胞修复酶的作用下形成闭合环状DNA (cccDNA)0随后，病毒以cccDNA为模板转录产生四种 mRNA，分别是 3.5kb 的 pgRNA、2.4kb 的 mRNA、2.1kb 的 mRNA 和 0.8kb 的 mRNA。
2.4kb和2.1kb的mRNA指导表面 蛋白的翻译；0.8kb的mRNA指导X蛋白的翻译；而3.5kb的PgRNA除了指导核心蛋白和聚合酶的翻译外，还作为病毒的前基因组RNA，被新产生的核心蛋白和聚合酶包裹，形成新的核衣壳。在核衣壳中，病毒聚合酶以pgRNA为模板通过反转录合成新的DNA基因组。最终，完成DNA复制的核衣壳被表面蛋白包裹，形成成熟的病毒粒子，分泌出细胞，开始新的感染周期。
[0005]在HBV感染者的血清中可见三种不同形态的病毒颗粒，即大球型颗粒(又称为Dane颗粒)、小球形颗粒和管型颗粒。虽然这三种形式的颗粒都具有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，但是只有大球型颗粒内部含病毒的双链DNA分子，并具感染性。同时值得注意的是，小球形颗粒，也称亚病毒颗粒，一般在血液中可比Dane颗粒多出10，000至1，000，000倍。部分病人自然感染状态下会出现保护性抗体。研究表明，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的主要抗原为“a”决定簇。免疫显性“a”表位在所有病毒血清中存在。治疗慢性病毒感染的抗体都是抗HBsAg。
[0006]人抗乙肝病毒抗体(HBIG)系从乙型肝炎疫苗免疫健康人群中，采集高效价血浆或血清后，分离提取制备的免疫球蛋白制剂，在临床上被用于降低HBV的感染率。在中国和其它HBV高发地区，母婴传播是HBV的主要的感染途径之一。临床研究显示，HBIG与重组HBV疫苗联合使用是目前阻断HBV母婴传递最有效的手段，其保护率达95%左右。乙肝表面抗原(HBsAg)阳性母亲所产新生儿出生后24h内使用乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白(HBIG)，已在《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》中被建议。器官移植后乙肝病毒感染是影响手术成功率的主要因素。高剂量的HBIG抑制肝脏移植后HBV再感染率的成功率达60%至85%。临床研究表明，围产期的母婴传播率与母体病毒载量高度相关，肝脏移植后HBV再感染的风险也与病毒载量直接相关。HBIG的使用可能降低病毒的载量。
[0007]由于HBIG的生产和临床应用分别存在着血源稀缺和血源性传播疾病感染等隐忧，重组型人抗乙肝单抗(mAb)已受到了医药产业界的关注。值得注意的是，虽然治疗性单抗药物(mAbs)在过去的20年里已悄然成为推动生物医药产业发展的主力，但是单抗技术在感染性疾病领域的应用相对滞后，目前只有一个抗-呼吸道合胞病毒的单抗药物用于临床。Shlomo Dagan等人在2001年报导了两个抗HBV人单抗的联合用药的一期临床试验结果后，有关抗HBV单抗的研究进展缓慢，其中的一个重要原因，就是缺乏评估重组人抗乙肝单抗(HlAb)中和病毒能力的评估系统。
[0008]与HIV和HCV不同，HBV至今未建立可靠的细胞感染模型和动物保护模型。多年以来，人原代肝细胞是研究HBV病毒感染性唯一的一种细胞。但是，人原代肝细胞很难培养，不能在体外繁殖并且需要特殊的生长因子来维持其原代的分化状态。即使在培养过程中加入二甲基亚砜(DMSO)和聚乙二醇(PEG)，也只能有限的改善HBV病毒的感染力感染细胞以扩增病毒的能力。再加上来源困难等其它问题，人原代肝细胞很难被应用到以细胞为基础的体外中和实验中。人肝癌细胞系(HepG2)细胞在培养中加入二甲基亚砜(DMSO)和5-aza_2'-脱氧胞啶后能探测到病毒抗原的存在，可是，这个结果的重复性差。从原发性肝癌和慢性HCV共感染的一位女性病人中分离出的IfepaRG细胞在感染前先通过二甲基亚砜(DMSO)和皮质醇(hydrocortisone)的前处理达到了成功感染HBV的目的,但这个细胞系不是很稳定且处理过程繁琐。而且，成功建立HBV感染的人细胞系只能产生病毒颗粒，不能用于体外病毒中和实验。
[0009]树駒的原代肝细胞被发现具有感染人HBV的能力，并且感染后能探测到乙肝表面抗原和乙肝e抗原的分泌的能力。有些实验室正用树駒的原代肝细胞作为多肽抗体的评估。但是，只有原代分离的树駒肝细胞具有感染和复制病毒能力。时效性短，来源复杂，可重复率低，也限制了它应用到体外中和病毒实验中。
[0010]利用抗体工程技术可以设计、构建、表达和生产具有高度特异性的抗病毒单克隆抗体。如何检测和判定单抗的抗感染能力，去伪存真，是将单抗成功导入临床应用的关键。虽然细胞感染模型和动物保护模型已成功应用于部分病毒，如Hiv和HCV等的研究，但是，受体外细胞感染系统培养和感染条件及动物模型的异种性等因素的限制，细胞感染模型和动物保护模型的实际应用效率和价值尚待观察。此外，一些具高度种属，组织和细胞特异性的病毒感染，如HBV感染，以及一些新发和突发性的感染病毒，至今还没有相应的细胞感染和动物保护模型。因此，医疗和制药界急需一个快速，高效和通用的检测系统，作为现有方法和手段的补充。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是提供一种在快速有效的测定抗感染分子抗病毒能力的方法。
[0012]本发明的另一个目的是利用上述检测方法筛选具有抗HBV感染的小分子化合物、蛋白或者核酸。
[0013]本发明要解决的问题是建立一个快速有效的检测系统，以界定抗HBV单抗和其它抗病毒分子和制剂的抗感染能力。
[0014]临床研究显示，HBV被动免疫和HBIG主动免疫都可以有效的控制HBV的感染率，提示虽然HBV病毒感染的靶细胞为肝细胞，血液却是抗HBV感染的主要屏障。此外，业界都清楚，无论是细胞感染模型、动物保护模型还是临床感染，病毒的感染率都与病毒的载量相关。因此本发明假设，受试分子在血液中调控病毒载量的能力，与其抗感染能力相关。并在此基础上，利用沉降性病毒复合物技术，建立了一个新的抗感染检测系统。
[0015]闻玉梅等利用沉降性抗原抗体复合物技术，设计和生产了具有免疫再生能力的治疗性疫苗，并应用于持续性乙型肝炎的基础研究和临床治疗，该技术已获得国内外专利。沉降性病原体复合物是对沉降性抗原/抗体复合物技术的延伸。病原体复合物是包含病原体以及表面粘联分子的多聚体。
[0016]沉降性病原体复合物技术的新颖性是利用不同的病毒复合物在血样中的不同沉降条件，以及感染性病毒颗粒的分子特点，检测受试样品从血样中清除病毒的能力。病毒与单抗和其它抗病毒分子和制剂可以借助静电力、氢键、范德华力等次级键可逆性结合而形成的多分子复合物。
[0017]本发明提供了一种检测和评价抗病毒感染活性的方法，通过检测受试分子在血清中诱导产生沉降性病原体复合物的能力，检测分子的抗病毒和抗感染能力。
[0018]该方法依次包括下列步骤:
[0019](I)取离体血液样本，分离获得病原体血清样本；
[0020](2)将病原体血清样 本与试剂A和试剂B混合后，加入受试分子；
[0021](3)步骤(2)获得的混合物在4-37摄氏度静置0.5-15小时，以1，000-12，000转/分的速度离心30分钟；
[0022](4)离心后的混合物取上清分离病原体核酸后，测定病原体核酸量。
[0023]所述的病原体是病毒，例如在实施例中针对的是HBV病毒。
[0024]步骤(3)所述的离心的速度，较好的是10，000-12，000转/分。
[0025]用荧光实时PCR定量测定病原体核酸量。
[0026]所述的沉降性病原体复合物包括病原体和表面粘联分子的多聚体。其中，病原体可以是病毒，例如在实施例中针对的是HBV病毒。
[0027]本发明中涉及一种沉降性病原体复合物，该沉降性病原体复合物包括病原体和表面粘联分子的多聚体。所述的病原体是病毒。
[0028]利用该方法检测受试样品从血样中清除病毒的过程如下。含病原体血清样本与检测价抗病毒感染活性的试剂混合后，加入受试分子。混合物在特定温度中静置后，离心。取上清分离病原体核酸后，测定病原体核酸量。
[0029]样品在特定条件下病毒的清除率的计算方法是:
[0030]病毒的清除率=(对照组病毒载量(Xe)-样品组病毒载量(Xt)) /对照组病毒载量(Xe)。
[0031 ] 上述方法中，可以将混合物置于在离心试管中。
[0032]静置的时间是0.5-15小时，静置的特定温度的范围是4-37度(摄氏度)。[0033]静置后的离心速度的范围是1，000-12，000转/分，较好的5，000-10，000转/分。尚心时间可以是20-60分钟。例如米用30分钟。
[0034]测定病原体核酸量可以使用荧光实时PCR定量测定法。
[0035]含病原体血清样本与检测价抗病毒感染活性的试剂可以按比例混合。混合比例为1:1000-10:1，体积比。
[0036]其中，检测抗病毒感染活性的试剂包括试剂A和试剂B。所述的试剂A是表面粘联分子的多聚体。
[0037]利用上述检测和评价抗病毒感染活性的方法可以筛选并界定具抗感染能力的受测分子(受试分子)。所述的受测分子是抗HBV的多克隆抗体或者单克隆抗体。
[0038]已知病毒可以通过物理的、化学的方法，分离和纯化。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:密度梯度离心、PEG沉淀等。与超离心法相比，本发明无需超离心机等仪器和设备，操作过程简单易行；与PEG沉淀法相比，本方法具病毒特异性沉降等特点，有临床实用性。
[0039]酶联免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays, ELISA)是常用的免疫检测手段，临床上用于检测抗乙肝病毒表面抗体，抗乙肝病毒衣壳抗体等。与ELISA相比，本发明所检测的病毒和抗感染物质之间的相互作用发生在液相的血清中，没有受到器皿和其它粒子表面分子的影响，具有生理学和病理学意义。
[0040]利用本发明的方法检测了 HBIG，人抗HBV单抗BC1，人IgG，人白蛋白，和其它动物IgG清除病人血清中HBV病毒的能力。结果显示，在同样蛋白浓度条件下(1-50微克/毫升)，HBIG和人抗HBV单抗的病毒 清除率在70%以上，与人IgG，人白蛋白和异源IgG比较，HBIG和人抗HBV单抗具特异性清除HBV的能力。
[0041]本发明利用沉降性病毒复合物技术，建立了一种检测和评估分子抗病毒能力的新方法。利用该方法可以快速检测抗体和其它抗感染药物清除病毒和控制病毒感染的能力。本方法操作过程简单，结果重复性好，是对现有抗病毒药物功能性检测和评估方法的补充，该方法的建立为目前还没有有效的细胞和动物感染模型病毒(如HBV)的药物研发，提供了一种新的选择。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1:HBV单抗与HBIG的病毒清除能力。
[0043]图2:沉降相关性实验。
[0044]图3:人HBV单抗的特异性。
【具体实施方式】
[0045]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述:例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989) ； ((DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984);《蛋白质纯化:原理和实践》第2版(Springer-Verlag,N.Y.),以及《实验免疫学手册》1-1V卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)，或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
[0046]实施例1:HBV单抗与HBIG的抗感染性能力
[0047]利用本发明建立的检测方法，分别检测HBV单抗与HBIG的抗病毒活性。HBIG为由中生集团生产的人抗乙肝病毒球蛋白，人源化抗乙肝病毒单克隆抗体由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。
[0048]具体检测步骤是:
[0049](1)取离体血液样本，分离获得病原体血清样本；
[0050](2)将病原体血清样本与试剂A和试剂B按1:4.5:4.5混合后，加入0.5%Volume受试分子(分为HBV单抗组和HBIG组)；
[0051](3)室温静置3小时，以10，000转/分的速度离心30分钟；
[0052](4)离心后的混合物取上清分离病原体核酸后，荧光实时PCR定量测定病原体核酸量。样品在特定条件下病毒的清除率的计算方法是:
[0053]100%-〔对照组病毒载量(Xe)-样品组病毒载量(Xt) ) /对照组病毒载量(Xe)。
[0054]结果显示，HBV单抗的病毒清除率为87%，HBIG病毒清除率为96.8%。HBIG和抗HBV单抗同具抗病毒能力，两者间无显著性差异，HBV单抗与HBIG具生物等效性。
[0055]实施例2 =HBIG和抗HBV单抗的抗病毒能力与病毒复合物的形成和沉降相关
[0056]图2为沉降特异性实验的结果。
[0057]按照实施例1的方法检测病毒DNA，只是HBV单抗和HBIG处理血清样本后不做沉降处理，检测病毒DNA。
[0058]实验结果表明，不做沉降处理组的HBV单抗BCl和HBIG不能从血清中清除病毒。沉降性病毒复合体的形成和检测为检测的必要条件。
[0059]实施例3人HBV单抗BCl的特异性实验
[0060]图3为人HBV单抗BCl的特异性实验。
[0061]按照实施例1的方法检测病毒DNA。
[0062]结果显示，HBV单抗中和病毒的能力为93% (P=0.0001)，与HBIG中和病毒的能力没有显著性差异。与人血清白蛋对照相比，HBIG和抗HBV单抗BCl的病毒清除能力具特异性。
【权利要求】
1.一种检测和评价抗病毒感染活性的方法，其特征在于，通过检测受试分子在血清中诱导产生沉降性病原体复合物的能力，检测分子的抗病毒和抗感染能力；所述的病原体是病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法依次包括下列步骤: (1)取离体血液样本，分离获得病原体血清样本； (2)将病原体血清样本与检测试剂混合后，加入受试分子； (3)步骤(2)获得的混合物在4-37摄氏度静置0.5-15小时，以1，000-12，000转/分的速度离心30分钟； (4)离心后的混合物取上清分离病原体核酸后，测定病原体核酸量。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的分离病原体核酸的方法是密度梯度离心或者PEG沉淀。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的沉降性病原体复合物包括病原体和表面粘联分子的多聚体。
5.一种抗病毒感染活性的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂包括试剂A和试剂B0
6.如权利要求5所述的抗病毒感染活性的检测试剂，其特征在于，所述的试剂A是表面粘联分子的多聚体。
7.一种沉降性病原体复合物,其特征在于,该沉降性病原体复合物包括病原体和表面粘联分子的多聚体。
8.如权利要求7所述的沉降性病原体复合物，其特征在于，所述的病原体是病毒。
9.权利要求1所述的方法的应用，其特征在于，利用该方法筛选或者界定具有抗HBV感染的小分子化合物、蛋白或者核酸。
10.如权利要求9所述的应用，其特征是，利用该方法筛选或者界定抗HBV的多克隆抗体或者单克隆抗体。
【文档编号】C12Q1/68GK103468826SQ201210185329
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月6日 优先权日:2012年6月6日
【发明者】陈力, 闻玉梅, 王蕾, 谢幼华, 梁米芳 申请人:复旦大学