专利名称：一种竹蛏总科线粒体coiii基因的扩增引物的制作方法
技术领域：
本发明设计了竹経总科线粒体细胞色素c氧化酶亚基III (cytochrome c oxidaseIII ；C0III)基因的扩增引物。
背景技术：
竹経总科(Solenidea)隶属于属软体动物门(Mollusca),双壳纲(Bivalvia),异齿亚纲(Heterodonta)，在世界各地的海域均有分布。竹蛏总科中有许多我国重要的经济贝类，例如缢蛏、大竹蛏、长竹蛏、小刀蛏等，其均具有个体大、肉质鲜美、营养丰富等特点。近年来由于过度采捕、栖息地萎缩以及海洋环境的日益恶化，，这些经济种类的资源量逐年下降，需要采取有效措施保护这些自然资源，因此近年来许多竹蛏总科重要经济种类的人工 育苗研究已经开始进行。物种鉴定是种质资源保护和人工育苗工作的前提和基础，然而由于竹蛏总科许多种类的贝壳外部形态的高度相似性，特别是在稚贝、幼贝阶段单纯凭借形态特征很难区分，这就需要借助分子手段对物种进行鉴定。近年来，利用分子技术对物种进行分类和系统发育分析已成为一种有效的方法，其中线粒体COIII基因由于具有较高的进化速率已成为区分物种和研究物种进化关系的一种理想基因。因此，利用COIII基因对竹蛏总科各种类进行物种鉴定和系统发育分析是一种很好的方法，但目前国际上没有扩增竹蛏总科COIII基因通用引物的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种竹蛏总科线粒体COIII基因的扩增引物，它能满足现有技术的上述需求。本发明根据竹蛏总科物种COIII基因序列变异度较高和非特异性扩增引物扩增效率低的特性，通过比对竹蛏总科不同物种COIII基因序列设计出兼并扩增引物。采用本发明的竹蛏总科线粒体COIII基因的扩增引物，可以有效的扩增出竹蛏总科不同物种的COIII基因序列，其中包括该总科中我国所有的重要经济种类，填补了竹蛏总科COIII基因没有通用扩增引物的空白，对于利用COIII基因序列研究竹蛏总科的物种分类、保护竹蛏总科种质资源、开展竹蛏总科各重要经济贝类的人工育苗都具有重要意义。
具体实施例方式本发明的竹蛏总科物种COIII基因的扩增引物的筛选方法共分两个步骤a、以先前测得的竹蛏总科三个物种的线粒体基因组全序列中COIII基因的序列为基础，通过比对找出COIII基因相对保守的序列片段，设计兼并引物；b、将合成的兼并引物对竹蛏总科物种COIII基因进行扩增，检测其在竹蛏总科中的通用性和扩增效率。下面结合实施例对本发明作进一步说明I.样品采集于2008年 2012年，从中国沿海共采集竹蛏总科7个种类的210个个体。
2. DNA提取用苯酚-氯仿法对所采集样品进行DNA提取。3.数据来源先前研究中获得了竹蛏总科三个物种(缢蛏、大竹蛏、长竹蛏)的线粒体基因组全序列，并将数据上传美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi. nlm. nih. gov/)。(Genbank 登录号分别为纟益経 JN398366,大竹経 HQ703012,长竹経JN786377)。4.序列比对利用BioEdit软件将三个物种的线粒体基因组全序列中COIII基因的序列进行比对，找出比较保守、碱基变异度最小的序列片段。5.引物合成根据上述的比对结果，利用引物设计软件Primer5在碱基变异度最小的序列片段设计出I对兼并扩增引物。引物序列为C0III-600F
ATGTCffCGAACKGGffTATCAT 3’ ；C0III-600R :5’CCATGAAADCCAGTTATYACA 3’。6.引物扩增将上述扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的竹蛏总科7个种类的 210个个体。设置PCR热循环退火温度范围为40°C 60°C。7.扩增结果检测扩增产物用I. 5倍的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示，该引物可以有效地扩增竹蛏总科线粒体COIII基因，扩增效率达95%以上。利用此对引物扩增出的DNA片段长度约为600bp。8.特异性扩增引物扩增条件上述C0III-600F与C0III-600R扩增引物的10 μ LPCR反应体系为I μ L 10 X buffer, I μ L Mgcl2 (25mM), O. 8 μ L dNTP (2mM)，I μ L 引物C0III-600F(10yM)，lyI^|*C0III-600R(10yM)，0.05yL rTaq 酶(5u/ μ L), I μ L DNA模板(IOOng)，4. 15 μ L双蒸水。PCR热循环的退火温度为50°C。
权利要求
1.一对用于竹蛏总科贝类线粒体部分COIII基因序列扩增的引物COIII-6OOF和C0III-600R, 其特征是用10 U I PCR体系在特定的PCR扩增条件下进行目标片段扩增。
2.如权利要求I所述的泥蚶线粒体部分COIII序列扩增的引物，其特征是 C0III-600F :5’ATGTCWCGAACKGGWTATCAT 3’ ；C0III-600R:5’ CCATGAAADCCAGTTATYACA 3’。
3.如权利要求I所述的10ill PCR体系，其特征为I ii L 10 X buffer, I u LMgcl2 (25mM) ,0. 8 u L dNTP (2. 5mM)，I y L 引物 C0III-600F (10 y M)，I y L 引物C0III-600R(10uM),0. 05 u L rTaq 酶(5u/ u L), I U L DNA 模板(IOOng) ,4. 15 y L 双蒸水。
4.如权利要求I所述的特定的PCR扩增条件，其特征为94°C预变性3分钟，94°C变性45秒，50°C退火温度45秒，72°C延伸I分钟，共35个循环，最后72°C延伸5分钟。
全文摘要
一种竹蛏总科线粒体COIII基因的扩增引物，其特征是a、将三个竹蛏总科物种的线粒体基因组全序列中COIII基因的序列进行比对序列用BioEdit比对分析，确定其保守区域；b、在保守区域内用Primer Premier 5设计兼并引物并合成；c、提取竹蛏总科物种的DNA，将设计的引物在相应反应体系下进行PCR扩增；d、进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测其扩增效率。采用本发明的竹蛏总科线粒体COIII基因的扩增引物，可以有效的扩增出竹蛏总科不同物种的COIII基因，对于利用COIII基因序列研究竹蛏总科的物种分类、保护竹蛏总科种质资源、开展竹蛏总科各重要经济贝类的人工育苗都具有重要意义。
文档编号C12N15/53GK102766622SQ20121019267
公开日2012年11月7日 申请日期2012年6月6日 优先权日2012年6月6日
发明者孔令锋, 李琪, 远洋 申请人:中国海洋大学