专利名称：细菌过滤杯及其在生防细菌代谢物抑菌活性检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物农药研制中一种简易的细菌过滤杯及其在生防细菌代谢产物、生物农药抑菌活性检测中的应用。
背景技术：
近年来，国内外广泛利用有益微生物及其代谢产物抑制病原物的生存和活动，使生物防治发展迅速，其中生防细菌在植物病害防治中起到了非常重要的作用。拮抗作用是生防细菌的主要作用机制，指的是生防细菌在代谢过程中能产生并分泌到环境中的抗菌物质，一般在低浓度下就能对病原菌的生长和代谢产生抑制，甚至杀死病原菌。这种抗菌物质主要有抗生素、细菌素(杀菌蛋白或多肽)、胞外裂解酶、溶菌酶、蛋白酶、缺陷型噬菌体、月旨肽类、胞外多糖，以及一些氨类、有机酸等初始代谢途径中的副产品和其它次生代谢产物。芽孢杆菌属细菌在自然界分布非常广泛，能忍受多种不良环境，一些芽孢杆菌属细菌能产生抑制植物病原菌的抗菌物质，包括脂肽类、肽类、蛋白类等，而被广泛应用于植物病害的 生物防治。实验条件下，通常采用平板对峙法依据待测细菌和病原菌之间的抑菌带宽度进行生防细菌的初步筛选。而关于生防细菌发酵液代谢产物抑菌活性检测和评价，多采用含药平板法，测定无菌发酵液对病菌菌落生长的影响，或采用牛津杯法，依据抑菌圈直径大小，测定无菌发酵液对病菌孢子萌发的影响。目前无菌发酵液的制备方式大致有细菌过滤器除菌、高温灭菌及有机溶剂萃取法。(I)细菌过滤器除菌法生防细菌发酵液高速离心后，取其上清液用细菌过滤器过滤，经无菌检测后方能使用，操作上不方便，且细菌过滤器成本较高，采用含药平板法检测该发酵液的抑菌活性时，往往需要较多的无菌滤液，采用无菌滤液牛津杯法，其加样量虽少，但受管底、管壁的作用，可能会影响生防细菌发酵液的扩散方向和扩散量，生测时形成的抑菌斑不一定规则，且对抑菌圈大小相同、清晰度不同的发酵液无法进行定量区别；(2)高温灭菌法可能导致发酵液中部份不耐高温的抑菌代谢物失活，影响试验结果的可靠性和真实性；
(3)有机溶剂萃取法只能评价生防细菌发酵液中具有某一极性的抑菌活性物质，操作过程较为复杂，通常需要使用大量的发酵液和有机溶剂进行萃取。
发明内容
本发明针对上述问题，提出了一种简易的细菌过滤杯，该细菌过滤杯结构简单，成本低廉，适用方便。本发明的技术方案在于一种细菌过滤杯，其特征在于包括筒形杯体，所述筒形杯体的杯底开设有一圆孔，所述圆孔上设有一层过滤网，所述过滤网上设有一水琼脂层，所述水琼脂层的上表面设有用于放置生防细菌发酵液的凹槽，所述杯底外周壁上设有支撑脚。本发明的另一目的在于采用细菌过滤杯进行生防细菌代谢物抑菌活性的检测，该检测方法操作性好，对生防细菌代谢物的抑菌活性检测结果准确。本发明的另一技术方案在于一种细菌过滤杯的制备方法及其在生防细菌代谢物抑菌活性检测中的应用，其特征在于按以下步骤进行操作
(1)取一灭菌的大玻璃平皿，在其内制作I.8%水琼脂平板，其中水琼脂平板的厚度为
3mm ；
(2)取一底部带有过滤网的筒形不锈钢杯体，所述筒形不锈钢杯体的底部设有一圈高度为3mm的支撑脚，将筒形不锈钢杯体放在步骤(I)的水琼脂平板上，稍压使杯底的支撑脚接触大玻璃平皿的皿底，其中大玻璃平皿的直径大于筒形不锈钢杯体的直径；
(3)在步骤(2)的筒形不锈钢杯体内注入温度为5(T60°C的水琼脂，使得杯中水琼脂的高度为elmm，然后立即放入一灭菌的小玻璃平皿，使其漂浮在水琼脂中间，待水琼脂凝固后，取出小玻璃平皿，使筒形不锈钢杯体内形成一个深度为3 4_的水琼脂凹槽，其中筒形不锈钢杯体的直径大于小玻璃平皿的直径；
(4)将步骤(I)中的水琼脂平板移除，并用无菌刀片刮除粘附在过滤网底部的水琼脂，细菌过滤杯即制作完成；
(5)另取一灭菌的小玻璃平皿，在其内制作PSA培养基平板，其中PSA培养基平板的厚度为2 3_ ；
(6)另取一灭菌的大玻璃平皿，将灭菌的小玻璃平皿的皿盖放入大玻璃平皿中；
(7)用灭菌的培养基打孔器在步骤(5)所述的PSA培养基中打孔，取出一片PSA培养基圆片，并将PSA培养基圆片移置在步骤(6)的小玻璃平皿的皿盖上；
(8)将步骤(I) (4)中制好的细菌过滤杯放在步骤(7)的PSA培养基圆片上方，并使细菌过滤杯底部的过滤网与PSA培养基圆片直接接触；
(9)在步骤(8)所述的细菌过滤杯内的水琼脂层表面的凹槽中用移液枪注入待测的细菌发酵液，在超净工作台上或在无菌条件下静置15h以上,使杯中的细菌发酵液的代谢物经水琼脂滤除菌体后，充分而自然地渗透到PSA培养基圆片中，多余的无菌体发酵液可沿着小玻璃平皿皿盖的外沿流入大玻璃平皿内；
(10)将细菌过滤杯移除，将被无菌体的发酵液及其代谢物渗透的PSA培养基圆片移至与一无菌的玻璃平皿内；
(11)在步骤(10)所述的PSA培养基圆片中接入指示病原菌菌丝块，于28°C的黑暗环境中培养72h，测量指示病原菌菌丝块的菌落生长直径，同时在步骤(9)所述的另一 PSA培养基圆片中以无菌水代替细菌发酵液作为空白对照。
图I为本发明的细菌过滤杯的结构示意图。其中1为筒形杯体，2为圆孔，3为过滤网，4为水琼脂层，5为水琼脂层上的凹槽，6为筒形杯体的支撑脚，7为大玻璃平皿，8小玻璃平皿的皿盖，9为PSA培养基圆片。
具体实施例方式一种细菌过滤杯，其特征在于包括筒形杯体1，所述筒形杯体的杯底开设有一圆孔2，所述圆孔上设有一层过滤网3，所述过滤网上设有一水琼脂层4，所述水琼脂层的上表面设有用于放置生防细菌发酵液的凹槽5，所述杯底外周壁上设有支撑脚6。所述筒形杯体为不锈钢筒形杯体，所述过滤网为不锈钢过滤网，所述筒形杯体的支撑脚高度为3mm，过滤网的孔径为1mm，所述凹槽深度为3 4mm，凹槽底部与过滤网之间的水琼脂厚度为3 4mm。一种细菌过滤杯的制备方法及其在生防细菌代谢物抑菌活性检测中的应用，其特征在于按以下步骤进行操作
(1)取一灭菌的直径为89mm大玻璃平皿，在其内制作I.8%水琼脂平板，其中水琼脂平板的厚度为3mm ；
(2)取一底部带有过滤网的筒形不锈钢杯体，所述筒形不锈钢杯体的底部设有一圈高 度为3mm的支撑脚，将筒形不锈钢杯体放在步骤(I)的水琼脂平板上，稍压使杯底的支撑脚接触大玻璃平皿的皿底，其中大玻璃平皿的直径大于筒形不锈钢杯体的直径；
(3)在步骤(2)的筒形不锈钢杯体内注入温度为5(T60°C的水琼脂，使得杯中水琼脂的高度为6 7mm，然后立即放入一灭菌的直径为59mm小玻璃平皿，使其漂浮在水琼脂中间，待水琼脂凝固后，取出小玻璃平皿，使筒形不锈钢杯体内形成一个深度为3 4mm的水琼脂凹槽，其中筒形不锈钢杯体的直径大于小玻璃平皿的直径；
(4)将步骤(I)中的水琼脂平板移除，并用无菌刀片刮除粘附在过滤网底部的水琼脂，细菌过滤杯即制作完成；
(5)另取一灭菌的小玻璃平皿，在其内制作PSA培养基平板，其中PSA培养基平板的厚度为2 3_ ；
(6)另取一灭菌的大玻璃平皿7，将灭菌的小玻璃平皿的皿盖8放入大玻璃平皿中；
(7 )用灭菌的培养基打孔器在步骤(5 )所述的PSA培养基中打孔，取出一片PSA培养基圆片9，并将PSA培养基圆片移置在步骤(6)的小玻璃平皿的皿盖上；
(8)将步骤(I) (4)中制好的细菌过滤杯放在步骤(7)的PSA培养基圆片上方，并使细菌过滤杯底部的过滤网与PSA培养基圆片直接接触；
(9)在步骤(8)所述的细菌过滤杯内的水琼脂层表面的凹槽中用移液枪注入待测的细菌发酵液，在超净工作台上或在无菌条件下静置15h以上,使杯中的细菌发酵液的代谢物经水琼脂滤除菌体后，充分而自然地渗透到PSA培养基圆片中，多余的无菌体发酵液可沿着小玻璃平皿皿盖的外沿流入大玻璃平皿内；
(10)将细菌过滤杯移除，将被无菌体的发酵液及其代谢物渗透的PSA培养基圆片移至与一无菌的玻璃平皿内；
(11)在步骤(10)所述的PSA培养基圆片中接入指示病原菌菌丝块，于28°C的黑暗环境中培养72h，测量指示病原菌菌丝块的菌落生长直径，同时在步骤(9)所述的另一 PSA培养基圆片中以无菌水代替细菌发酵液作为空白对照。首先以实施例一墨水跟踪显色实验说明本发明中细菌发酵液可以通过细菌过滤杯内的水琼脂层并充分扩散至PSA培养基中。实施例一墨水跟踪显色观察 I)材料与方法
取直径为89_的大玻璃平皿制作PSA培养基平板，并用培养基打孔器在PSA培养基平板上打出直径50mm的圆孔，去除孔中的培养基后在孔中注入15%的墨水2. 5ml,在室温条件下，分别于4h，6h，15h，24h后定点观察墨水在PSA培养基平板中的扩散情况，测量墨水扩
散距离；
同时采用本发明所述的细菌过滤杯检测方法，细菌过滤杯的尺寸如下筒形杯体直径75mm，所述筒形杯体的杯底开设有一直径为55mm圆孔，所述圆孔上设有一层过滤网，过滤网的筛网孔径为1_，所述过滤网上设有一水琼脂层，水琼脂层厚度6 7_，所述水琼脂层的上表面设有用于放置生防细菌发酵液的凹槽，凹槽深度为3 4mm，凹槽底部与过滤网之间的水琼脂厚度为3 4mm，所述杯底外周壁上设有支撑脚，支撑脚高度为3mm ;在细菌过滤杯的水琼脂凹槽中加15%墨水3ml，室温条件下分别渗透处理4h、5h、6h、8h和15h后，观察不同时间过滤杯底部PSA培养基圆片着色程度；
同时在直径为89mm的PSA培养基平板中采用牛津杯法，即用牛津杯打孔，去除孔底PSA圆片，在每个牛津杯中加入15%的墨水IOii 1,15h后观察墨水扩散及其显色圈情况。2)结果与分析
15%墨水在PSA平板中处理若干小时候，得到如表I所示的结果，由表I可知，15%墨水在PSA平板中分别处理4h、6h、15h和24h后，形成的黑色带宽度值分别为5. 0mm、6. 9mm、11. Omm和11. 9mm,各处理间差异显著,说明墨水能在PSA平板中横向扩散,其黑色物质能渗透到培养基中，形成的黑色带宽度值随墨水处理时间延长而增加。表I 10%墨水在PSA平板中横向扩散的速率
权利要求
1.一种细菌过滤杯，其特征在于包括筒形杯体，所述筒形杯体的杯底开设有一圆孔，所述圆孔上设有一层过滤网，所述过滤网上设有一水琼脂层，所述水琼脂层的上表面设有用于放置生防细菌发酵液的凹槽，所述杯底外周壁上设有支撑脚。
2.根据权利要求I所述的细菌过滤杯，其特征在于所述筒形杯体为不锈钢筒形杯体，所述过滤网为不锈钢过滤网。
3.根据权利要求I所述的细菌过滤杯，其特征在于所述筒形杯体的支撑脚高度为3mm,过滤网的孔径为1mm。
4.根据权利要求I所述的细菌过滤杯，其特征在于所述凹槽深度为3 4mm，凹槽底部与过滤网之间的水琼脂厚度为3 4_。
5.一种细菌过滤杯的制备方法及其在生防细菌代谢物抑菌活性检测中的应用，其特征在于按以下步骤进行操作 (1)取一灭菌的大玻璃平皿，在其内制作I.8%水琼脂平板，其中水琼脂平板的厚度为3mm ； (2)取一底部带有过滤网的筒形不锈钢杯体，所述筒形不锈钢杯体的底部设有一圈高度为3mm的支撑脚，将筒形不锈钢杯体放在步骤(I)的水琼脂平板上，稍压使杯底的支撑脚接触大玻璃平皿的皿底，其中大玻璃平皿的直径大于筒形不锈钢杯体的直径； (3)在步骤(2)的筒形不锈钢杯体内注入温度为5(T60°C的水琼脂，使得杯中水琼脂的高度为elmm，然后立即放入一灭菌的小玻璃平皿，使其漂浮在水琼脂中间，待水琼脂凝固后，取出小玻璃平皿，使筒形不锈钢杯体内形成一个深度为3 4_的水琼脂凹槽，其中筒形不锈钢杯体的直径大于小玻璃平皿的直径； (4)将步骤(I)中的水琼脂平板移除，并用无菌刀片刮除粘附在过滤网底部的水琼脂，细菌过滤杯即制作完成； (5)另取一灭菌的小玻璃平皿，在其内制作PSA培养基平板，其中PSA培养基平板的厚度为2 3_ ； (6)另取一灭菌的大玻璃平皿，将灭菌的小玻璃平皿的皿盖放入大玻璃平皿中； (7)用灭菌的培养基打孔器在步骤(5)所述的PSA培养基中打孔，取出一片PSA培养基圆片，并将PSA培养基圆片移置在步骤(6)的小玻璃平皿的皿盖上； (8)将步骤(I) (4)中制好的细菌过滤杯放在步骤(7)的PSA培养基圆片上方，并使细菌过滤杯底部的过滤网与PSA培养基圆片直接接触； (9)在步骤(8)所述的细菌过滤杯内的水琼脂凹槽中用移液枪注入待测的细菌发酵液，在超净工作台上或在无菌条件下静置15h以上，使杯中的细菌发酵液的代谢物经水琼脂滤除菌体后，充分而自然地渗透到PSA培养基圆片中，多余的无菌体发酵液可沿着小玻璃平皿皿盖的外沿流入大玻璃平皿内； (10)将细菌过滤杯移除，将被无菌体的发酵液及其代谢物渗透的PSA培养基圆片移至与一无菌的玻璃平皿内； (11)在步骤(10)所述的PSA培养基圆片中接入指示病原菌菌丝块，于28°C的黑暗环境中培养72h，测量指示病原菌菌丝块的菌落生长直径，同时在步骤(9)所述的另一 PSA培养基圆片中以无菌水代替细菌发酵液作为空白对照。
全文摘要
本发明涉及一种细菌过滤杯及其在生防细菌代谢物抑菌活性检测中的应用，本发明依据细菌菌体不能透过水琼脂培养基，但细菌代谢产物能在水琼脂培养基中扩散且细菌发酵液能渗透水琼脂培养基的原理，设计了一种结构简单的细菌过滤杯，并应用于生防细菌发酵液中代谢产物的抑菌活性检测，适用于生物农药研制过程中的生防细菌发酵液抑菌活性测定、菌株培养配方筛选、菌剂生产工艺优化及生物农药产品抑菌活性物质的稳定性检测。
文档编号C12M1/12GK102703308SQ20121019313
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者何玉仙, 杨秀娟, 甘林, 石妞妞, 陈福如 申请人:福建省农业科学院植物保护研究所