专利名称：一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白及制备方法
技术领域：
本发明提供一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白，本发明还公开了所述的蛋白的制备方法，具体涉及坏死梭杆菌白细胞毒素主要抗原表位融合基因的构建及真核表达，属于生物工程领域。
背景技术：
腐蹄病(footrot)是发生于牛、羊、鹿等家养和野生动物蹄部的一种常见疾病，由坏死梭妖舊QFusobacterium necrophorum，F. necrophorum)引起，具有高度接触传染性。该病不仅影响动物的正常活动与生活能力，还能导致动物生产性能明显下降，如果处理不当甚 至造成动物被淘汰，给我国反刍动物养殖业造成巨大经济损失，其预防和控制已直接关系到我国反刍动物养殖业能否持续稳定发展。然而传统灭活疫苗因细菌培养困难、灭活不完全等缺点，影响了疫苗的生产与应用。白细胞毒素是ー种对反刍动物白细胞具有特异性细胞毒性作用的细菌外毒素，被认为是F. flecroMoriffl 感染反刍动物形成腐蹄病的主要毒力因子,并成为了研制预防鹿、牛腐蹄病基因工程疫苗的首选靶标。但是由于白细胞毒素全基因表达产物稳定性差，易降解；其结构基因ジ重组蛋白又对表达宿主有裂解作用而造成无法通过基因工程手段获得重组白细胞毒素蛋白；后来Narayanan等另辟蹊径将IktA截断形成5个彼此部分重叠，但覆盖从M整个ORF的基因片段(bsbse、X、GAS、SH和FINAL)后，成功表达鉴定出bsbse和·^两个重要抗原表位；同时还发现存在众多抗原表位以及在白细胞毒素天然结构正确折叠过程中有重要的作用的^as基因。这些研究结果提示，截短表达的白细胞毒素重组蛋白具有抗原获取方便，保护性抗原区域精确等优势，可以作为研制新型重组疫苗以取代传统灭活疫苗。但迄今为止一直未见有商品化疫苗出现；究其原因可能与単独重组蛋白BSBSE和SH成本太高，抗原的免疫原性较低等缘故；另外从经济角度考虑，原核表达系统也不适合于大规模商业化生产有夫。目前利用酵母表达系统开发牛、羊、鹿等反刍动物腐蹄病重组亚单位疫苗在国内外还未见报道，但在理论上是可行的。酵母菌培养简单、方便、所需培养基价格也较低。表达产物经过粗提即可应用。因此，利用酵母表达系统生产牛、羊、鹿等反刍动物腐蹄病重组亚单位疫苗具有良好的前景。
发明内容
本发明提供一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白，目的之一在于该蛋白不仅能用于生产疫苗、还能作为血清抗体的捕获剂。本发明还提供一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白的制备方法，该方法可用于坏死梭杆菌截短重组蛋白エ业化生产。本发明的技术解决方案如下
本发明公开的坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ No. 12所示、其DNA序列如SEQ No. 11所示。本发明所述的坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白的制备方法，包括如下步骤
(1)以坏死梭杆菌FN(4)株基因组DNA为模板，
结合引物对I :
上游引物5’ -TACTACGTAAGCGGCATCAAAAGTAACGTTCAG-3,
下游引物5’ -TACGGATCCTCCACCTCCATCTACTGGAATGATTCCAT-3’ ；
结合引物对2 :
上游引物5 ’ - GTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3 ’，
下游引物5’ -TACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’ ； 扩增gas-sh基因片段；
(2)连接gas-sh基因片段至pMD 18-T载体，并以连接产物为模板，
结合引物对3 :
上游引物5 ’ -CAAGGATCCGGAGGTGGAGGCAGCGTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3，，
下游引物5’ - TCCGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’ ；
PCR扩增基因片段；
(3)体外连接bsbse和gas-sh基因片段，
结合引物对4 :
上游引物5’ _ CAAGGATCCGGAGGAGGAGGCAGCACAGAGTCTGATGCGGTAATTGC-3，,
下游引物5’ - TCAGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’ ；
PCR扩增获得bsbse-gas-sh融合基因，其核苷酸序列如SEQ No. 13所示；
(4)BamEI和ZAo I分别酶切融合基因bsbse-gassh和pPIC9K，构建重组表达质粒pPIC9K - bsbse-gassh ；
(5)线性化表达质粒，转化表达宿主菌诱导表达，得坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白。本发明所述的坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白制备方法，其特征在于 步骤5)中宿主菌为毕赤酵母KM71H，在甲醇诱导终浓度为1%吋，连续诱导表达4d。本发明所述的坏死梭杆菌白细胞毒素截段重组蛋白制备方法的引物为
(1)引物I:
上游引物 I :5’ -TACTACGTAAGCGGCATCAAAAGTAACGTTCAG-3,
下游引物 2 :5’ -TACGGATCCTCCACCTCCATCTACTGGAATGATTCCAT-3> ；
(2)引物II
上游引物 3 :5’ - GTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3’，
下游引物 4 :5’ -TACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3 ； ’
(3)引物III
上游引物 5 :5’ -CAAGGATCCGGAGGTGGAGGCAGCGTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3，,
下游引物 6 :5’ - CCGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’ ；
(4)引物IV
上游引物7:
5’ - CAAGGATCCGGAGGAGGAGGCAGCACAGAGTCTGATGCGGTAATTGC-3，,
下游引物 8 :5’ - TCAGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3。
本发明的积极效果在于利用甲醇酵母作为转化受体菌，其表达产物活性高，生产规模容易放大，成本低廉。在同一个表达宿主体内同时表达/7. flecroMorw 白细胞毒素的2个主要抗原(かかe和i)以及与毒素天然构象形成有关的^^基因，有利于生产具有高生物活性的坏死梭杆菌白细胞毒素重组蛋白。可以用于生产预防当下流行的鹿、牛腐蹄病的疫苗。在另一方面，新型基因工程疫苗相对于传统疫苗具有更低成本，能有效地減少腐蹄病发生,降低鹿、牛的养殖成本。
图I为本发明的坏死梭杆菌白细胞毒素/ / fgas-i融合基因库的载体示意 图2为坏死梭杆菌白细胞毒素bsbse基因和gas-sh基因PCR扩增结果；
图3为bsbse-gas-sh融合基因PCR鉴定结果；
图 4 为 ρΜ0 18- 5ν^5(9"ν<3·5-5 酶切鉴定结果；
图5为毕赤酵母转化子PCR鉴定结果；
图6为重组蛋白BSBSE GAS-SH的SDS-PAGE分析；
图7为重组蛋白BSBSE GAS-SH的Western Blot分析。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本本发明作进ー步阐述，应该理解的是，这些实施例仅用于 例证目的，绝不限制本发明的保护范围。实施例I
坏死梭杆菌白细胞毒素主要抗原基因重组酵母表达载体的构建
I材料和方法
I. I菌种、载体和宿主
坏死梭杆菌{Fusobacterium necrophorum, FN) FN ⑷株、大肠杆菌{Escherichiaco 11) TOPlO均为中国农业科学院特产研究所省部共建特种经济动物分子生物学国家重点实验室保存；pMD18-T质粒购自TaKaRa公司，KM71H毕赤酵母、pPICZC与pPIC9K表达载体购自Invitrogen公司。主要试剂
T4 DNA Ligase，位Taq聚合酶，限制性内切酶Afoi I、ガa H I^aB I，细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒和高范围蛋白Marker均购自TaKaRa公司；HRP标记山羊抗兔IgG购自中杉金桥；G418购于上海前尘生物科技有限公司；藤黄节杆菌酶(zymolyase)购于合肥博美生物科技有限责任公司。试剂与培养基配制
常见试剂与培养基的配制參照试剂说明书及分子克隆试验指南完成。主要仪器
垂直板电泳槽、电泳仪、水平摇床北京市六一仪器厂；PCR仪(美国MJ公司);凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；
I.6实验方法
质粒提取、聚合酶链式反应、酶切反应、DNA片段回收、连接和转化表达宿主等基因工程研究領域常规操作方法，參照《分子克隆实验指南》完成；重组蛋白鉴定和免疫原性分析分别參照《蛋白质技术手册》和《分子克隆实验指南》完成。具体详述如下
1.7坏死梭杆菌白细胞毒素ガ融合基因的构建 1.7.1引物设计
根据GeneBank已公布坏死梭杆菌白细胞毒素序列(AF312861)，并结合牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株从M的抗原表位的分析，利用Primer Premier 5. O软件和Oligo 6. O设计Mse (528 bv), gassh (2913 bp)基因片段的扩增引物，引物由生エ上海生物工程公司合成。
权利要求
1.一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白，其特征在于 其氨基酸序列如SEQ No. 12所示,其DNA序列如SEQ No. 11所示。
2.构建权利要求I所述的坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白的方法，包括如下步骤 (1)以坏死梭杆菌FN(4)株基因组DNA为模板，结合引物对I扩增bsbse基因片段；结合引物对2扩增gas-sh基因片段； (2)连接gas-sh基因片段至pMD 18-T载体，并以连接产物为模板，结合引物对3进行PCR扩增gas-sh基因片段； (3)体外连接bsbse和gas_sh基因片段,结合弓I物对4进行PCR扩增获得bsbse_gas_sh融合基因，其核苷酸序列如SEQ No. 11所示； (4)BamH I和Xho I分别酶切融合基因bsbse-gas-sh和pPIC9K，构建重组表达质粒pPIC9K - bsbse-gas-sh ； (5)线性化表达质粒，转化表达宿主菌诱导表达，得坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白。
3.权利要求2所述的坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白制备方法，其特征在于步骤5中宿主菌为毕赤酵母KM71H，在甲醇诱导终浓度为1%吋，连续诱导表达4d。
4.权利要求2所述的坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白制备方法，其特征在于所述的引物对为 Cl)引物对I : 上游引物5’ -TACTACGTAAGCGGCATCAAAAGTAACGTTCAG-3, 下游引物5’ -TACGGATCCTCCACCTCCATCTACTGGAATGATTCCAT-3’ ； (2)引物对2: 上游引物5’ - GTGAACAATGAAGTTTCTGCA-3’， 下游引物5’ -TACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3 ； ’ (3)引物对3: 上游引物5’ -CAAGGATCCGGAGGTGGAGGCAGCGTGAACAATGAAGTTTCT-GCA-3， 下游引物5’ - CCGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3’ ； (4)引物对4: 上游引物5’ _ CAAGGATCCGGAGGAGGAGGCAGCACAGAGTCTGATGCGGTAATTGC-3’， 下游引物5’ - TCAGCGGCCGCTACTCCGGCTGCAAGAATTCCA-3。
全文摘要
本发明公开一种坏死梭杆菌白细胞毒素截短片段重组蛋白及其制备方法。重组蛋白的核苷酸序列如SEQNo.11所示，氨基酸序列如SEQNo.12所示；利用基因工程技术，克隆核苷酸序列并连接至pPIC9K表达载体，转化毕赤酵母KM71H并诱导表达重组蛋白。Westernblot检测证明，重组蛋白具有免疫原性。
文档编号C12N15/31GK102690337SQ20121019383
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者冯二凯, 刘晓颖, 徐晶, 陈立志 申请人:陈立志