专利名称：大豆疫霉卵孢子发育相关转录因子Myb基因的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因领域,具体涉及一种大豆疫霉Myb转录因子基因。
背景技术：
大豆疫霉是一种极为重要的植物病原菌，由其引起的大豆根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。该病原菌可以在大豆的各个生育期侵染大豆，一般发生年份减产10-30%，重病田块可减产60%，甚至绝产。尽管我国于上世纪80年代后期才在东北地区首次发现大豆疫霉，但目前该病已在我国部分地区扩散并成为东北、安徽和福建等大豆主产区的主要病害，在一些年份，其造成的大豆产量损失高达50%以上。人们广泛地选育抗病品种防治此病，但由于该病原菌的致病性易变，新的致病小种的产生易导致新选育的抗病品种失去利用价值。因此，大豆疫霉根腐病的防治始终是大 豆生产上的一个重要难题，而控制该病原菌的一个重要前提是了解其生长发育与致病过程的分子机制，寻找阻断其生长与致病过程的分子靶标。转录因子在真核生物的生命活动中起着重要的调控作用，某个或某些基因在特定时期的打开或关闭则决定了所有生物有机体的特征性状，在整个基因组水平上了解基因的表达与调控是阐明疫霉菌生长发育与致病性的关键，对转录因子的研究将有助于明确疫霉菌细胞内基因调控的网络和相互作用。Myb转录因子，是指含有Myb结构域的一类转录因子。最早是在鸟成髓细胞白血病病毒(vaian myeloblastosis viurs, AMV)中发现。后来，在拟南芥和玉米中，大量的Myb转录因子也被发现，它们能够广泛参与植物发育和代谢调节。Myb转录因子家族成员以含有Myb结构域为共同特征，每个Myb结构域通常由51-52个氨基酸组成，含有3个规则间隔的色氨酸残基，这些氨基酸残基使Myb结构域折叠成螺旋-转角-螺旋(HeIix-Turn-HeIix，HTH)结构。脊椎动物中有三种Myb转录因子，分别为c_Myb，A-Myb和B-Myb，都含有3个重复的Myb功能域。植物基因组编码大量的基因，这些基因广泛的参与植物的多种生命活动。但是大量的植物地基因是只含有两个Myb DNA结合域，被称为R2R3-Myb，也有少量的基因含有3个Myb DNA结合域，被称为3R_Myb。Myb蛋白虽然在序列上有一定的保守性，在结构上有一定的相似性，但不同的物种、不同的个体，甚至同一个体不同的组织器官之间，Myb蛋白的功能也存在着重大差异。分析大 疫霉中Myb转录因子的作用，明确Myb转录因子在大 疫霉中的功能，从而为寻找化学分子作用于Myb转录因子，抑制其功能，控制大豆疫霉生长或发育的某一环节，造成病害繁殖体的缺失，进而达到控制病害发生与传播。这些研究工作的开展对控制大豆疫霉根腐病具有重要的理论和实践价值，为开发以病原真菌生长发育为靶标的新型高效、低毒的杀菌剂具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种大豆疫霉与卵孢子发育相关的Myb转录因子基因，该基因对于进一步深入了解大豆疫霉与卵孢子发育过程，并通过化学药剂手段调控大豆疫霉与卵孢子发育，从而为控制大豆疫霉根腐病的发生起到重要作用。为了解决上述技术问题，本发明提供一种大豆疫霉与卵孢子发育相关的Myb转录因子基因，为SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。本发明还同时提供了编码上述大豆疫霉与卵孢子发育相关的Myb转录因子基因的蛋白质，为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。本发明还同时提供了上述大豆疫霉与卵孢子发育相关的Myb转录因子基因的用途，用于杀菌剂的作用靶标。本发明的Myb转录因子基因全长1969bp,从cDNA (互补脱氧核糖核酸)中克隆的编码序列(CDS)序列为1818bp,该基因中存在3个外显子序列，如图I所不，翻译后的蛋白质由605个氨基酸残基组成。 与其他生物的Myb转录因子一样，PsMybl也含有一个“SHLQKYR(Ser-His-Leu-Gln-Lys-Tyr-Arg,丝氨酸-组氨酸-亮氨酸_谷氨酰胺_赖氨酸_酪氨酸-精氨酸)”保守序列，如图2下划线部分所示。将该基因沉默后进行基因功能分析，得到的沉默的突变体中卵孢子的形成受到影响，沉默突变体产生极少量的卵孢子。本发明的有益技术效果是本发明提供了大豆疫霉与卵孢子发育相关的Myb转录因子基因，本发明产5##7基因的主要作用是能够调控其靶基因转录，控制大豆疫霉卵孢子的发育，在控制大豆疫霉根腐病中具有很高的应用价值，以该基因为作用靶标，开发的杀菌剂对控制大豆疫霉根腐病的发生与流行具有重要的实践意义。
图I是PsMybl基因结构模式。图2是PsMybl蛋白质氨基酸序列，下划线部分序列为Myb脱氧核糖核酸结合区域保守序列。图3是实时定量聚合酶链式反应筛选沉默突变体。图4 IPsMybl沉默突变体的卵孢子产量明显下降。野生型菌株(WT)、对照菌株(CK)和沉默突变体(M3、M9、M10和M16)在LBA上培养10天，显微镜下观察卵孢子
的产量。图5是PsMybI沉默突变体的卵孢子产量测量的定量结果。野生型菌株(WT)、对照菌株(CK)和沉默突变体(M3、M9、M10和M16)在LBA上培养10天，显微镜下观察卵孢子的产量。
具体实施例方式供试菌株
供试菌株为大豆疫霉全基因组测序标准菌株P26,购自美国菌种保藏中心(AmericanType Culture Collection)。菌株保存在10% V8固体培养基，保存温度是10摄氏度。大豆品种Williams对大豆疫霉菌株P26的侵染表现为感病，由南京农业大学国家大豆改良中心提供。
数据库信息和同源检索
大豆疫霉数据库(http://genome, jgi-psf. org/Physo3/Physo3. home, html)
橡树疫霉数据库(http://genome, jgi-psf. org/Phyral_l/Phyral_l. home, html)
致病疫霉数据库(http://www. broad, mit. edu)
疫霉菌功能基因组数据库(http://www. pfgd. org/)。序列比对分析
将得到的大豆疫霉基因在欧洲生物信息学中心(European BioinformaticsInstitute, EBI)的网站(www. ebi. ac. uk/clustalw)上用 culstal W 软件进行多重序列比对，无需改动用其默认值即可。核糖核酸(RNA )的提取和反转录聚合酶链式反应(Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction, RT-PCR)
核糖核酸的提取使用的是Trizol (Invitrogen ,美国英杰Invitrogen公司)，液氮研磨组织，按100毫克组织加入I毫升Trizol，转移入离心管，用电动匀浆器充分匀浆I分钟。加Trizol后，室温放置5分钟，使其充分裂解。12000转/分钟离心5分钟，弃沉淀，按I毫升Trizol加入200微升氯仿，振匀，室温放置15分钟，4摄氏度下12000转/分钟离心15分钟。吸取上层水相，至另一离心管中。按每毫升Trizol加入O. 5毫升异丙醇并混匀，室温放置10分钟。摄氏度下12000转/分钟离心10分钟，弃上清，核糖核酸沉于管底。按每毫升Trizol加入I毫升75%乙醇的比例加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4摄氏度下8000转/分钟离心5分钟，弃上清。室温晾干或真空干燥5到10分钟。用50微升水,溶解核糖核酸。核糖核酸反转录使用ThermoScript反转录酶(ThermoScript ,美国英杰Invitrogen公司)体系进行，先把下列组分加到反转录聚合酶链式反应管中浓度为50微摩尔/毫升的Oligo (dT)20(多聚胸腺嘧啶20)(Invitrogen ，美国英杰Invitrogen公司)，I微升；总核糖核酸，2微克；10毫摩尔/毫升的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合物(Invitrogen ,美国英杰Invitrogen公司),2微升；加焦碳酸二乙酯(DEPC) (solarbio ，上海索莱宝生物科技有限公司)水12微升。65° C保温5分钟至于冰上,后依次加入一下组分5倍的单链脱氧核糖核酸(cDNA)综合缓冲液(SynthesisBuffer) (Invitrogen ,美国英杰Invitrogen公司)4微升；浓度为O. I摩尔/升的的二硫苏糖醇(DTT) (Invitrogen ,美国英杰Invitrogen公司)1微升；浓度为40单位/微升的RNaseOUT (Invitrogen ,美国英杰Invitrogen公司)I μ I ;灭菌水I μ I ;浓度为15单位 / 微升的 ThermoScript RT (ThermoScript ,美国英杰 Invitrogen 公司)I μ I。将混合物轻轻混匀，50摄氏度保温60分钟，再85摄氏度保温5分钟，所获得的单链脱氧核糖核酸(cDNA)置于零下20摄氏度备用。PsMybl脱氧核糖核酸序列扩增和蛋白质编码序列分析
PsMybl的脱氧核糖核酸序列从菌株P26基因组中和单链脱氧核糖核酸(cDNA)中通过聚合酶链式反应扩增得到。引物序列为上游引物5’ -ATGGCAAATTTGGCCCCCGC-3’，下游引物5’ - TTACGACTTCAGGAAACAGATC- 3’，程序为94摄氏度2分钟，然后94摄氏度30秒、52摄氏度30秒和72摄氏度2分钟，进行30个循环。聚合酶链式反应产物克隆到pMD18_T载体上并测序验证。蛋白质编码序列由大豆疫霉数据库(http://genome.jgi-psf.org/Physo3/Physo3. home, html)中获得；从大豆疫霉基因组DNA和cDNA中克隆出全长序列并测序。经过比对发现，PsMybl基因全长1969bp，从cDNA中克隆的⑶S序列为1818bp，该基因中存在3个外显子序列，参见图I，翻译后的蛋白质由605个氨基酸残基组成，参见图2。构建PsMybl反向转化载体
首先用内切酶5)^1酶切载体pham34，回收纯化后与高保真扩增产物相连接。连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用pham34启动子上游引物和下游引物PCR扩增筛选反向插入的克隆。大豆疫霉遗传转化
1)配制40%聚乙二醇10mL :称取6 g聚乙二醇4000放于50毫升烧杯中，于超净台中依次加入3. 75毫升0.8摩尔/升甘露醇，3毫升0.5摩尔/升氯化钙和3毫升水，搅拌溶解； 2)用纱布和200毫升烧杯收集菌丝，并用镊子将菌丝放入含有O.8摩尔/升甘露醇的培养皿中漂洗将漂洗过后的菌丝移入盛有O. 8摩尔/升甘露醇的离心管中室温摇洗10分钟；
3)用灭过菌的50毫升烧杯快速称取O.I克Lyzing酶和O. 06克纤维素，盖紧杯口迅速拿回超净台。并依次加入10毫升0.8摩尔/升甘露醇，8毫升水，800微升0.5摩尔/升氯化钾，800微升0.5摩尔/升脂肪酸甲酯磺酸盐(pH5. 7)和400微升0.5摩尔/升氯化钙，充分溶解酶液后将其倒入50毫升离心管，并加入已洗好的菌丝，25摄氏度下40转/分钟酶解45-60分钟；
4)用两层孔径22-25 微米的滤膜(Miracloth. Calbiochem, La Jolla, CA)和烧杯过滤收集原生质体，收集好以后倒入新的离心管中，1500转/分钟，3分钟后轻轻倒掉上清液；
5)用35毫升W5溶液(154毫摩尔氯化钠，125毫摩尔氯化钙，5毫摩尔氯化钾，毫摩尔葡萄糖，PH 5. 8))洗涤原生质体，1500转/分钟，4分钟后轻轻倒掉上清液；
6)用5毫升W5溶液重悬原生质体至浓度为2X IO6个/毫升，冰置30分钟后1500转/分钟，离心4分钟，轻轻倒掉上清液；
7)用5毫升W5溶液重悬原生质体，室温放置10分钟；
8)取新的离心管放于冰上，在管底加入3-4微升的pTH209质粒；
9)在每个含有质粒的离心管中加入I毫升原生质体，冰置5-10分钟；
10)每个离心管加I. 74毫升聚乙二醇，分三次加入，每次580微升，轻轻混匀，冰置20分钟；
11)将离心管中液体倒入准备好的培养皿中，25°C静置培养过夜；
12)将培养皿中的液体吸进50毫升离心管，每分钟2000转离心5分钟后吸去上清，剩余2毫升左右液体；
13)将15毫升准备好的培养基倒入离心管，混匀后倒入培养皿中25摄氏度黑暗培养。PsMYBl沉默突变体的表型分析
利用聚乙二醇介导的原生质体稳定转化的方法将该基因沉默后进行基因功能分析，筛选得到了四个沉默的突变体，分别编号为M3、M9、M10和M16。相比较野生型的受体菌株(WT)和对照菌株(CK)J1Si^W在四个沉默突变体中的表达量分别为M3为5. 6%、M9为20. 9%, MlO 为 O. 3% 和 M16 为 O. 7%，参见图 3。PsMybl基因沉默突变体中卵孢子的形成受到影响，PsMybl沉默突变体产生极少量的卵孢子，参见图4。分别切取2X2厘米的琼脂块测定卵孢子产量，结果表明沉默突变体的卵孢子产量明显下降，参见图5。本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的描述了本发明的具体实施方案，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方 案和实例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。
权利要求
1.大丑疫霉卵孢子发育相关转录因子基因的用途，大丑疫霉Myb转录因子基因为SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；大豆疫霉Myb转录因子基因的蛋白质为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，其特征在于大豆疫霉Myb转录因子基因的用途作为杀菌剂的作用靶标。
全文摘要
本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域，具体为大豆疫霉卵孢子发育相关转录因子Myb基因的用途。其具有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列。大豆疫霉Myb转录因子PsMyb1基因为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；大豆疫霉Myb转录因子PsMyb1基因的蛋白质为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，本发明PsMyb1基因的主要作用是能够调控其靶基因转录，控制大豆疫霉卵孢子的发育。本发明提供的基因在控制大豆疫霉根腐病中具有很高的应用价值，以该基因为作用靶标，开发的杀菌剂对控制大豆疫霉根腐病的发生与流行具有重要的实践意义。
文档编号C12N15/31GK102776207SQ20121019996
公开日2012年11月14日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者杜家亮, 王子迎, 王朝霞 申请人:合肥师范学院