专利名称：星形孢菌素的制备方法
技术领域：
本发明属于化合物合成的技术领域，主要涉及一种利用发酵方法制备星形孢菌素的制备方法。
背景技术：
农药是解决世界粮食问题，保证农作·物稳产、高产不可缺少的重要物资，同时也是一个能获得巨大经济利益和社会效益的产业。然而，化学农药残留所引起的环境污染、人畜中毒、病虫抗药性增强等问题日趋严重，大力研究、开发、生产和应用生物农药，已成为全球农业产业发展的新趋势。目前世界各国正在采取实际步骤减少化学农药的使用，如美国环保局曾宣布撤销91种化学农药的登记；欧盟制定了减少一半化学农药使用量的五年和十年计划。我国也将发展生物农药和绿色食品列入《中国21世纪议程》。因此，创制和开发拥有我国自主知识产权、高效、安全的生物农药是实现我国农业可持续发展的迫切需要。星形孢菌素由Omura等(1977)首次从S. staurosporeus代谢产物中分离，是一类口引哚生物碱类抗生素。随后，S. actuosus、S. roseoflavus等从链霉菌中分离获得。研究证明，星形孢菌素是一类非特异性蛋白激酶C抑制剂，能够诱导细胞凋亡，具有抗肿瘤活性。目前，国外研究多集中于其生物活性及抗肿瘤、抗癌的机理。尽管Staurosporine是一种典型的三磷酸腺苷竞争性激酶抑制剂，但由于其非特异性而限制了在临床上的应用，目前，已明确了该化合物的生物合成途径，由于其结构合成的复杂性和重要的生理活性而引起了众多有机合成化学家的兴趣，将其作为先导化合物开发潜在的抗癌抗肿瘤潜在药物将成为今后研究的重点。在植物病害防治研究方面，S. roseoflavus strain LS-A24产生的星形孢菌素对多种细菌和植物病原真菌具有较强的抑制作用，且对辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)引起的辣椒疫病具有良好的防治作用。链霉菌是放线菌中产生抗生素种类最多的属，目前，大约发现了 550种链霉菌，而且仍然有新的种在不断被发现。在已发现的链霉菌中，只有少数种是植物病原菌，其中，疮痂链霉菌是引起马铃薯疮痂病的主要病原菌之一。目前国内外对马铃薯病原菌的研究主要集中在多样性、致病性、毒素及其遗传多样性等方面，近年来国外已有报道将其作为有益菌株进行开发研究。在国内还未见将链霉菌作为生防菌株进行研究的相关报道，因此，将该菌作为生防菌株进行发酵条件的优化和代谢产物的分离纯化等方面的研究具有重大的意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种星形孢菌素的制备方法。由疮痂链霉菌许吕亚种产生的星形孢菌素对多种植物病原真菌具有很强的拮抗作用，对TMV也有较强的体外钝化作用，具备作为农用抗生素的开发潜力。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案一种星形孢菌素的制备方法，所述的星形孢菌素的分子式为C28H26N4O3,结构式为
权利要求
1.一种星形孢菌素的制备方法，所述的星形孢菌素的分子式为C28H26N4O3,结构式为
2.权利要求I所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于发酵所述疮痂链霉菌许吕亚种CGMCC No. 5213的培养基的组成为可溶性淀粉2wt %，黄豆饼粉4wt %，MgSO4O.075wt%, K2HPO4 O. IwtFeSO4 · 7H20 O. 001wt%，余量为水。
3.权利要求2所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于发酵所述疮痂链霉菌许吕亚种CGMCC No. 5213的发酵条件为发酵温度28°C、转速200r/min，发酵时间5d。
4.权利要求3所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于发酵所述疮痂链霉菌许吕亚种CGMCC No. 5213的最佳发酵条件为初始pH 7.0,发酵温度28°C，种子液种龄48h，接种量6wt%,转速200r/min,发酵时间5d。
5.权利要求1-4任一项所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于还包括分离纯化步骤，并且其分离纯化步骤发酵液经无水乙醇预处理后，采用乙酸乙酯萃取，萃取液通过硅胶柱层析和硅胶薄层层析，层析液再经高效液相。
6.权利要求5所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于所述的乙酸乙酯萃取步骤是指将3倍体积的乙酸乙酯加入到浓缩10倍的预处理发酵液中，然后动态萃取2h，静止30min，收集有机相，反复萃取3次，合并有机相，减压蒸干得乙酸乙酯相，再用体积比为II的氯仿和甲醇混合溶液溶解有机相得到所述萃取液。
7.权利要求6所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于所述的硅胶柱层析步骤包括取柱层用硅胶，用无离子水浸泡3h，抽干；再用浓HCl洗涤除去残留的铁和铝，然后用无离子水洗至中性，抽干，用无水乙醇浸泡过夜，抽干；120°C干燥至恒重；然后，采用石油醚-氯仿-甲醇梯度洗脱，先用石油醚洗脱，然后逐渐增大氯仿的比例，最后增大到用甲醇把所有斑点洗脱下来，洗脱速度I. OmL/min，按洗脱梯度分管收集；以紫外吸收法和滤纸片法测定洗脱液抑菌活性；合并活性组分，减压浓缩，即得粗提品。
8.权利要求7所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于所述的硅胶薄层层析步骤包括薄板的制备称取薄层层析用硅胶30g，羟甲基纤维素钠O. 3g，加无离子水IOOmL,研磨均匀后，按照每块板约3g硅胶的量，均匀铺板，室温下自然风干，使用前置于烘箱中120°C活化30min，其中板的大小为5CmX20Cm;展层剂为氯仿和甲醇，氯仿和甲醇的体积比为10 1 ;将上述所得的粗提品溶于体积比为I : I氯仿和甲醇的溶液样品，沿横线均匀点在薄板上，横线距薄板底端的距离为I. 5cm，点样量约50 μ L，上行展层；展层完毕后，将薄板取出，自然风干，置于紫外光照箱中观察、照相，用铅笔在薄板上标出所显示的带谱，利用生物活性测定找到活性带谱；用无菌水将指示菌枣青霉病菌制成孢子悬液，待熔化的PDA培养基放置至45°C左右时混入其中，定量倒入平板，凝固后，将展层完毕后并经紫外线灭菌薄板轻轻反扣在平板上，轻轻压平，静置45min，取下毒板，置25°C恒温培养箱培养48h，观察活性组分的出现情况并测定Rf值。
9.权利要求8所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于所述的高效液相色谱纯化步骤包括取硅胶薄层样品充分溶于甲醇中，用O. 45μπι微孔过滤器过滤，自动进样器进样，每次进样量为I. 5mL ;以100%甲醇为流动相，3. 5mL/min的泵流速进行循环分离，利用UV检测器在波长291nm处检测所对应的洗脱液并进行活性检测，将所得样品真空浓缩干燥得到星形孢菌素。
全文摘要
本发明涉及一种星形孢菌素的制备方法，所述的星形孢菌素的分子式为C28H26N4O3，其是通过发酵疮痂链霉菌许吕亚种CGMCC No.5213制备得到的。本发明利用疮痂链霉菌发酵生产星形孢菌素，为星形孢菌素的生产提供了新的途径。由疮痂链霉菌许吕亚种产生的星形孢菌素对多种植物病原真菌具有很强的拮抗作用，对TMV也有较强的体外钝化作用，具备作为农用抗生素的开发潜力。
文档编号C12R1/465GK102925511SQ201210201598
公开日2013年2月13日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者文才艺 申请人:文才艺