专利名称：一种肿瘤用药个体化指导的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测方法，尤其是一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的肿瘤用药个体化指导的检测方法。
背景技术：
目前经常应用的有实时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR等，都是针对特异性靶基因进行检测。其中，荧光定量PCR检测方法最为成熟。荧光定量PCR技术的优点是灵敏性高，并可精确定量，在对EGFR，BRAF, KRAS等的检测中都取得了良好效果。利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，并利用一 种新型探针在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中突变的检测，具有很高的特异性和敏感度。其中目前在肿瘤个体化分子诊断领域最重要的EGFR、KRAS、BRAF三种基因突变检测试剂产品已获得SFDA《医疗器械注册证》和欧盟CE认证。荧光定量PCR的缺点通量低，一次只能检测一个基因，如需要检测多种相关基因突变，SNP，表达情况，就需要多台PCR仪同时工作，效率低，周期长；成本相对较高因一次只能检测一个基因位点，当一个样品同时需要检测多种肿瘤相关基因时，必须一个一个检测，成本相对增高；不适用于检测固定包埋后的病理组织，但患者可供的多数是固定后的组织；只能设定一个内参基因(管家基因)，但肿瘤组织的管家基因有别于正常组织，需要一组管家基因作内参；只能同步检测最多三种基因，但个体化治疗需要同步检测十几种甚至更多的基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的肿瘤用药个体化指导的检测方法。本发明采用如下技术方案一种肿瘤用药个体化指导的检测方法，包括如下步骤(I)采集患者样品，并提取核酸；(2)以患者核酸为模板进行反转录；(3)以反转录产物为模板进行PCR反应；(4)以毛细电泳的方法分离样品。优选地，所述步骤(I)中的患者样品包括新鲜、冰冻肿瘤组织等等。优选地，所述步骤(2)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后在一定温度下孵育的子步骤。优选地，所述步骤(2)中的孵育温度分别为48°C、42°C、95°C、4°C。优选地，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。优选地，所述步骤(3)的子步骤中的热循环温度分别为95°C、94°C、55°C、70°C、
4。。。本发明的有益效果为1.灵敏度高、重复性好采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度。
2.准确性强采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性。3.高通量本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测30-40个位点，可同时做192个反应(如192个患者样品，每个样品检测11个相关基因)，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。4.精确定量可精确定量基因突变，SNP，表达拷贝数。5.灵活性强可随时根据需求调整检测的靶基因，例如新发现的靶向位点，可立即设计特异性引物，将其放入“肿瘤个体化治疗用药指导多重基因检测方案”中去。
6.成本低每个样品的检测成本少于Y50,利于大规模推广。
具体实施例方式下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。本发明创立了一种同步检测11种常见肿瘤个体化治疗相关基因的多重基因检测方案。检测步骤采集患者样品(新鲜，冰冻组织等)，提取核酸，以患者核酸为模板进行反转录和PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品。1.检测的基因及内容包括(表I)。2.建立了可靠地样品质量及反应过程的对照(表I)a)人RNA完整性的对照内参确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性。b)正常反应对照内参监控PCR反应效率，避免假阴性。表1:
权利要求
1.一种肿瘤用药个体化指导的检测方法，包括如下步骤 (1)采集患者样品，并提取核酸； (2)以患者核酸为模板进行反转录； (3)以反转录产物为模板进行PCR反应； (4)以毛细电泳的方法分离样品。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤用药个体化指导的检测方法，所述步骤(I)中的患者样品包括新鲜、冰冻肿瘤组织。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤用药个体化指导的检测方法，所述步骤(2)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后在一定温度下孵育的子步骤。
4.根据权利要求3所述的一种肿瘤用药个体化指导的检测方法，所述步骤(2)中的孵育温度分别为 48 °C、42 °C、95 °C、4°C。
5.根据权利要求1所述的一种肿瘤用药个体化指导的检测方法，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。
6.根据权利要求5所述的一种肿瘤用药个体化指导的检测方法，所述步骤(3)的子步骤中的热循环温度分别为95°C、94°C、55°C、70°C、4°C。
全文摘要
本发明公开了一种肿瘤用药个体化指导的检测方法，包括如下步骤(1)采集患者样品，并提取核酸；(2)以患者核酸为模板进行反转录；(3)以反转录产物为模板进行PCR反应；(4)以毛细电泳的方法分离样品。本发明一种肿瘤用药个体化指导的检测方法具有灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的优点。
文档编号C12Q1/68GK102994627SQ20121020658
公开日2013年3月27日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者吴勇, 李令栋, 南丽, 颜进, 王晴晴 申请人:海尔施生物医药股份有限公司