专利名称：一种基于毛细电泳的出疹性病原体的多重基因检测方法
技术领域：
本发明涉及一种检测方法，尤其是一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的基于毛细电泳的出疹性病原体的多重基因检测方法。
背景技术：
目前，我国出疹性病原体检测主要方法有如下几种1.病原体检查即直接做影像及活组织检查 ，或病原体分离培养，之后在显微镜、电镜下观察，做出诊断。此方法曾一度是微生物检测的经典方法，也是之后各种检测方法的基础平台，得到各个国家的认可，在我国一直沿用至今。优点成本低；对实验室硬件要求低。缺点(I)耗时长一般需3-5天或更长。(2)诊断效率低只能单菌纯培养；对一些表型特征变异的病原体，用形态学经验很难辨别；此外，由于抗生素的滥用，细菌在检测过程中生长受到抑制，导致假阴性的结果。(3)工作量巨大由于对每个抽检样品的每种菌都必须进行检测，工作量非常巨大，特别是部分对培养环境要求较为苛刻的菌，更加大了检测的工作量和难度。2.免疫学检查应用最广泛的是酶联免疫技术(ELISA):—般先用一抗与抗原发生特异性结合，然后用通用的酶标记的二抗与一抗发生特异性结合，再将酶显色，之后观察结果。优点⑴样品通量较高利用96孔酶标板，一块平板可完成多个样品的检测；⑵较敏感利用酶联的特性，可将原来的抗原信号放大；(3)快捷在时间上，比传统的培养基微生物培养检查法要缩短很多。缺点(1)易出现假阳性由于洗涤和抗原包被的操作，或由于抗原表面决定簇类似而发生交叉反应，故易出现假阳性(2);耗时耗力制作抗体是非常耗时耗力的工作(3);灵敏度不确定实验的灵敏度取决于抗体的好坏，而每个抗体的好坏不一，质量难以控制；(4)无法检测多变异的病毒变异性较快的病毒，如甲流病毒，存在多种亚型，并且经常变异，变异导致抗体失效，无法检测抗原，如禽流感病毒和猪流感病毒等。3.分子生物学-PCR检测方法。目前经常应用的有实时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR等，都是针对病原体的特异性靶基因进行检测。其中，荧光定量PCR检测方法最为成熟。荧光定量PCR技术的优点灵敏性高，并可精确定量，在对李氏杆菌、沙门氏菌、肉毒杆菌、大肠杆菌等的检测中都取得了良好效果。2004年，中国发布了实施荧光定量PCR检测禽流感H7亚型的国家标准。2009年，美国FDA批准了用荧光定量PCR检测猪流感HlNl亚型的试剂盒。荧光定量PCR的缺点(I)通量低一次只能检测一个病原成分，如需要检测多种病原菌，就需要多台PCR仪同时工作，效率低，周期长，对大批量的多种病原污染的样品更是无从下手；(2)成本相对较高因一次只能检测一个病原体，当一个样品同时需要检测多种病原菌时，必须一个一个检测，成本相对增高。4.分子生物学-基因芯片法基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。优点(1)高通量并行检测当一个样品同时需要检测多种病原菌时，一次实验即可得出全部结果；(2)操作简便快速整个检测只需4-8小时基本可以出结果。缺点(1)技术成本昂贵、复杂每个样品需要一个芯片，成本大于YlOOO/样品，不利于大规模推广；探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤；(2)不能精确定量，重复性差；(3)灵敏度较低芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度；(4)由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的基于毛细电泳的出疹性病原体的多重基因检测方法。本发明采用如下技术方案 一种基于毛细电泳的出疹性病原体的多重基因检测方法，包括如下步骤(I)生产“出疹性病原体多重基因检测试剂盒”；(2)采集患者样品，并提取核酸；(3)以患者核酸为模板进行反转录；(4)以反转录产物为模板进行PCR反应；(5)以毛细电泳的方法分离样
品O优选地，所述步骤(I)中的试剂盒包括反转录引物管、PCR引物管、反转录缓冲液、PCR缓冲液、25mM氯化镁、反转录酶、DNA聚合酶、荧光标记物、阳性对照。优选地，所述步骤(2)中的患者样品包括鼻咽拭子、痰液、疱疹液、血液等等。优选地，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后在一定温度下孵育的子步骤。优选地，所述步骤(3)中的孵育温度分别为48°C、42°C、95°C、4°C。优选地，所述步骤(4)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。优选地，所述步骤(4)的子步骤中的热循环温度分别为95°C、94°C、60°C、70°C、
4。。。本发明的有益效果为1.灵敏度高、重复性好采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度。2.准确性强采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性。3.高通量本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测15-40个位点，可同时做192个反应(如192个患者样品，每个样品检测14种出诊性病原体，23个位点)，一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。4.精确定量可精确定量病原体基因拷贝数。5.灵活性强可随时根据需求调整检测的靶基因。6.成本低每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广。
具体实施方式
下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。本发明创立了一种同步检测十六种常见出疹性病原体、二十二个靶位的多重基因检测方案。检测的病毒包括单纯疱疹病毒1，单纯疱疹病毒2型，水痘-带状疱疹病毒，非洲淋巴细胞瘤病毒，人类巨细胞病毒，人类疱疹6型病毒，人类疱疹7型病毒，肠道病毒及其亚型(柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型)，麻疫病毒，风疫病毒，细小病毒B19, 口蹄疫病毒及其亚型(口蹄疫病毒A型、O型、C型、Asia型、SAT1，2，3)，乙型溶血性链球菌，肺炎支原体等(表I)。建立了可靠的样品质量及反应过程的对照(表I)a)人DNA和人RNA完整性的对照内参确保在检验过程中对样品质量的判断，避 免假阴性。b)正常反应对照内参监控PCR反应效率，避免假阴性。出疹性病原体多重基因检测的引物设计(见表2核苷酸序列)表1.检测的靶位点
权利要求
1.一种基于毛细电泳的出疹性病原体的多重基因检测方法，包括如下步骤(1)生产“出疹性病原体多重基因检测试剂盒”；(2)采集患者样品，并提取核酸；(3)以患者核酸为模板进行反转录；(4)以反转录产物为模板进行PCR反应；(5)以毛细电泳的方法分离样品。
2.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(I)中的试剂盒包括反转录引物管、 PCR引物管、反转录缓冲液、PCR缓冲液、25mM氯化镁、反转录酶、DNA聚合酶、荧光标记物、阳性对照。
3.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(2)中的患者样品包括鼻咽拭子、痰液、 疱疹液、血液等等。
4.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后在一定温度下孵育的子步骤。
5.根据权利要求4所述的检测方法，所述步骤(3)中的孵育温度分别为48°C、42°C、 95。。、4。。。
6.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(4)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。
7.根据权利要求6所述的检测方法，所述步骤(4)的子步骤中的热循环温度分别为 95。〇、94。〇、60。〇、70。〇、4。〇。
全文摘要
本发明公开了一种基于毛细电泳的出疹性病原体的多重基因检测方法，包括如下步骤(1)生产“出疹性病原体多重基因检测试剂盒”；(2)采集患者样品，并提取核酸；(3)以患者核酸为模板进行反转录；(4)以反转录产物为模板进行PCR反应；(5)以毛细电泳的方法分离样品。本发明具有灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的优点。
文档编号C12Q1/70GK102994649SQ201210206599
公开日2013年3月27日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者吴勇, 周静晓, 黄迎彬, 陈燕芬 申请人:海尔施生物医药股份有限公司