一种利用cho细胞生产重组蛋白的真核表达载体及系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体公开了一种利用CHO细胞生产重组蛋白的基因表达系统及真核表达载体，所述真核表达载体包括GS表达单元，所述GS表达单元包括5’至3’方向依次排列的TK启动子基因序列、谷氨酰胺合成酶基因序列以及SV40polyA基因序列；本发明的表达系统包括真核表达载体及CHO细胞，该表达系统能够实现外源基因在CHO细胞基因组中的整合和高效表达，在蛋白制备领域具有广阔的应用前景。
【专利说明】—种利用CHO细胞生产重组蛋白的真核表达载体及系统【技术领域】[0001]本发明涉及基因工程领域，具体公开了一种利用CHO细胞生产重组蛋白的基因表达系统及真核表达载体。【背景技术】[0002]基因工程领域所用基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化修饰，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。哺乳动物细胞的规模化生产技术也日渐成熟和完善。因此，通过哺乳动物细胞培养表达制备治疗性重组蛋白质药物已经成为当今生物制药领域的主流技术。目前已经上市和正在进行临床试验的蛋白质药物中，主要来自于哺乳动物细胞， 而这其中中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)是最常用基因工程宿主细胞。[0003]为了获得高效的外源基因表达，基因工程CHO细胞中常使用二氢叶酸还原酶 (Dihydrofolatereductase, DHFR)和谷氨酸胺合成酶(Glutaminesynthetase, GS)进行基因扩增和筛选。谷氨酰胺合成酶表达系统(GS表达系统)往往只需一轮加压筛选，所需筛选时间短；另外由于携带有GS基因的细胞株在放大培养过程中不需要添加谷氨酰胺，因此， 受代谢副产物NH3毒的影响较小，有利于工艺优化及放大培养。[0004]利用GS、DHFR基因扩增和筛选系统的表达载体多由美国等发达国家开发，其专利保护、技术转让壁垒极大地限制了我国生物制药技术及工业的发展，因此现在急需一种具有自主知识产权的表达系统，以促进相关蛋白药物的开发和我国生物制药工业的进步。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种自主开发、具有自主知识产权的高效表达载体pHLXlOl，以及一种CHO细胞基因整合表达系统，以实现目的基因的筛选和高效表达。[0006]本发明第一方面公开了一种pHLXlOl真核表达载体,包括GS表达单兀,所述GS表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的TK启动子基因序列(TK promoter)、谷氨酰胺合成酶基因序列(GS)以及SV40polyA基因序列。[0007]所述TK启动子基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述谷氨酰胺合成酶基因序列如 SEQ ID NO:2所示；所述SV40poly A基因序列如SEQ ID NO:3所示。[0008]较优的,所述GS表达 单元基因序列如SEQ ID N0:4所示。[0009]较优的，所述GS表达单元的序列还可以包括酶切位点序列。所述GS表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的酶切位点序列、TK启动子基因序列(TK promoter)、谷氨酰胺合成酶基因序列(GS)、SV40 polyA基因序列以及酶切位点序列。[0010]更优的，所述酶切位 点序列选自HindIII酶、NotI酶、SmaI酶或SalI酶中的一种或多种。[0011]最优的，所述含有酶切位点的GS表达单元序列可以如SEQ ID NO:7所示。[0012]较优的，所述pHLXlOl真核表达载体是由pUC19质粒改造获得。[0013]更优的，所述pHLXlOl真核表达载体是在pUC19质粒的SmaI酶切位点和HindIII 酶切位点之间，插入所述GS表达单元构成的。[0014]本发明pHLXlOl真核表达载体的制备方法为:通过PCR的方法在GS表达单元的两端添加酶切位点序列，采用酶切、连接的方法将GS表达单元插入表达载体，筛选、鉴定连接正确的连接产物为本发明的pHLXlOl真核表达载体。[0015]具体方法为:[0016]I)插入序列的制备:利用引物 GS-TK5 (SEQ ID N0:5)和 GS-PA3 (SEQ ID NO:6)， 通过PCR的方法获得含有GS表达单元的插入序列(SEQ ID NO:7)；[0017]2)酶切:将pUC19质粒用SmaI和HindIII酶双酶切，将含有GS表达单元的插入序列用HindIII酶酶切，分别获得质粒片段和GS表达单元片段；[0018]3)连接:连接酶连接质粒片段和GS表达单元片段，获得连接产物；[0019]4)鉴定:连接产物转化感受态的大肠杆菌细胞，筛选阳性克隆，鉴定序列正确的连接产物为本发明的PHLX101真核表达载体。[0020]较优的，所述pHLXlOl真核表达载体适用于CHO细胞。[0021]更优的，所述pHLXlOl真核表达载体适用于CH0-K1细胞。[0022]本发明第二方面公开了一种PHLX101-CH0真核表达系统，包括本发明所述的 PHLX101真核表达载体以及中国仓鼠卵巢细胞。[0023]较优的，所述中国仓鼠卵巢细胞为CH0-K1细胞。[0024]本发明第三方面公开了利用前述pHLX101-CH0真核表达系统制备重组蛋白的方法，步骤如下:[0025]I)重组质粒的构建:将表达重组蛋白的外源基因表达单元插入pHLXlOl真核表达载体中，构建获得重组质粒；[0026]2 )表达系统的筛选:重组质粒转化CHO细胞，筛选稳定表达的细胞株作为 pHLXlO 1-CH0真核表达系统；[0027]3)采用上一步筛选的PHLX101-CH0真核表达系统表达重组蛋白。[0028]较优的，步骤I)中所述外源基因表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的启动子序列、外源基因序列以及终止信号和PoIyA加尾信号序列。[0029]更优的，步骤I)所述外源基因表达单元的序列还包括两端的酶切位点序列。[0030]更优的，步骤I)所述外源基因表达单元插入到pHLXlOl真核表达载体的限制性酶切位点之间。[0031]最优的，步骤I)所述 外源基因表达单元插入到pHLXlOl真核表达载体的EcoRV酶和Not I酶的限制性酶切位点之间，或者插入到SmaI酶和XmaI酶的限制性酶切位点之间。[0032]较优的，步骤I)具体为:将外源基因表达单元通过酶切、连接的方法插入pHLXlOl 真核表达载体，连接产物转化感受态细胞，筛选正确连接的载体作为构建成功的重组质粒[0033]所述筛选为采用添加有Amp的LB培养基选择培养转化了连接产物的感受态细胞， 挑取单克隆进行菌落PCR，对PCR产物电泳分析或者测序分析。[0034]较优的，步骤2)具体为:重组质粒转化CHO细胞后，通过MSX进行加压筛选，获得稳定表达的细胞株。[0035]较优的，所述MSX加压筛选的终浓度为10~100 μ mol。[0036]最后，本发明还公开了 pHLXlOl真核表达载体、pHLX101_CH0真核表达系统在重组蛋白表达中的应用。[0037]本发明公开了一种在CHO细胞中利用pHLXlOl真核表达载体生产重组蛋白的基因表达系统，该表达系统能够实现外源基因在CHO细胞基因组中的整合和高效表达。该系统的制备方法主要包括:构建真核表达载体，适合于目的基因在CHO细胞中的瞬时表达,并适合于目的基因高表达细胞株筛选。利用本发明的CHO表达系统可以实现重组蛋白、单克隆抗体等在CHO细胞中的整合和表达，具有广阔的应用前景。【专利附图】
【附图说明】[0038]图1:PCR法从pBSK-TK-GS-SV质粒扩增含GS表达单元基因片段的电泳结果(M: DNA marker LI:PCR 扩增片段)[0039]图2:GS表达单元及pUC19质粒酶切产物电泳结果(M、L5:DNA marker L1-L4: SmaI和Hind III限制性内切酶酶切pUC19质粒后的片段L6-L7 =Hind III限制性内切酶酶切 PCR产物后的片段)[0040]图3:菌落PCR结果电泳图谱(M:DNA marker L1-L24:不同克隆的PCR产物)[0041]图4:pHLX101真核表达载体的酶切鉴定电泳图谱(M:DNA marker L1、L2:限制性内切酶Sal I和限制性内切酶EcoRV.酶切pHLXlOl质粒后的片段)[0042]图5:pHLX101真核表达载体的质粒图谱[0043]图6:2009-HLX01-HC 和 2009-HLX01-LC 的 PCR 扩增产物电泳结果[0044]图7:pHLX101-HLX01-LC 的酶切鉴定结果及 pHLX101-HLX01-HC 的菌落 PCR 结果[0045]图 8:pHLX101-HLX01-HC HindIII 酶切鉴定[0046]图9:pHLX101-HLX01-LC 重组质粒图谱[0047]图10:pHLX101-HLX01-HC 重组质粒图谱[0048]图11:谷氨酰胺合成酶活性比较[0049]图12:pHLX101-eGFP重组质粒图谱[0050]图13:加压筛选后的细胞株荧光显微镜检图【具体实施方式】[0051]在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指`出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。[0052]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本【技术领域】技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本【技术领域】的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。[0053]除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本【技术领域】常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见SambiOOk 等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 and Third edition,2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York,1987 and periodic updates ； the series METHODS IN ENZYM0L0GY, Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY, Vol.304, Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe, eds.), Academic Press, San Diego,1999 ；和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119， Chromatin Protocols (P.B.Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 等。[0054]下面通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案。[0055]实施例1 pHLXlOl真核表达载体的构建[0056]1.标记基因表达单元的合成[0057]从NCBI数据库中获得了鼠源的谷氨酰胺合成酶基因序列(GS，Genebank登录号: NM 008131.3，ABC015086.1，X16314.1)、TK 启动子基因序列(TK promoter，Genebank 登录号 JN420340.1，AF104248.2，AF362551.1)以及 SV40polyA 基因序列(Genebank 登录号: JQ302818.1,HQ388295.LEF437954.1 )，基于这些序列，设计了利于GS基因在CHO细胞中整合及表达的GS表达单元(SEQ ID NO:4)，将设计的表达单元送交基因合成公司合成了该序列，合成的表达单元插入在PBSK载体中，获得TK-GS-SV-pBSK载体。[0058]13.真核表达载体pHLXlOl的构建[0059]2.1含有GS表达单元的基因片段的制备[0060]利用表1所示GS-TK5和GSPA3引物从TK-GS-SV-pBSK载体中通过PCR的方法扩增出含有GS表达单元的基因片段，并引入相应的酶切位点。[0061]表1 PCR引物序列[0062]引物名称I 5' 序列引入内切酶位点GS-TK5 Gggagtcgactataca gacatgataagatac (SEQ ID NO:5)Sma1-SalIGS-PA3 gccaagcttatgcggccgcgatatccccggaagaaatatattt (SEQ ID NO:6) HindII1-NotI[0063]PCR 反应条件:预变性 950C 3min ;变性 94°C 30s,退火 53°C 30s,延伸 72°C 2min, 31 循环；延伸:72°C IOmin0[0064]PCR产物的电泳图谱见图1，含有GS表达单元的PCR产物的基因序列如下:[0065]gccaagcttatgcggccgcgatatccccggaagaaatatatttgcatgtctttagttctatgatgacac aaaccccgcccagcgtcttgtcattggcgaattcgaacacgcagatgcagtcggggcggcgcggtccgaggtccact tcgcatattaaggtgacgcgtgtggcctcgaacaccgagcgaccctgcggacttccaccatggccacctcagcaagt tcccacttgaacaaaggcatcaagcaaatgtacatgtccctgccccagggtgagaaagtccaagccatgtatatctg
【权利要求】
1.一种PHLX101真核表达载体，包括GS表达单元，所述GS表达单元的序列包括5’至 3’方向依次排列的TK启动子基因序列、谷氨酰胺合成酶基因序列以及SV40 poly A基因序列。
2.如权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于，所述GS表达单元的基因序列如SEQ ID NO:4 所示。
3.如权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于，所述pHLXlOl真核表达载体是由 PUC19质粒改造获得。
4.如权利要求3所述的真核表达载体,其特征在于,所述pHLXlOl真核表达载体是在 PUC19质粒的SmaI酶切位点和Hind III酶切位点之间，插入所述GS表达单元构建获得。
5.一种pHLX101-CH0真核表达系统，包括权利要求1_4任一权利要求所述的pHLXlOl 真核表达载体以及中国仓鼠卵巢细胞。
6.如权利要求5所述的真核表达系统，其特征在于，所述中国仓鼠卵巢细胞为CHO-Kl 细胞。
7.利用权利要求5或6任一权利要求所述pHLXlO1-CH0真核表达系统制备重组蛋白的方法，步骤如下:O重组质粒的构建:将表达重组蛋白的外源基因表达单元插入pHLXlOl真核表达载体，构建获得重组质粒；2)表达系统的筛选:重组质粒转化CHO细胞，筛选稳定表达的细胞株作为pHLXlO1-CH0 真核表达系统；3)采用上一步筛选的pHLX101-CH0真核表达系统表达重组蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤I)具体为:将表达重组蛋白的外源基因表达单元通过酶切、连接的方法插入pHLXlOl真核表达载体，连接产物转化感受态细胞， 筛选正确连接的载体作为构建成功的重组质粒。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤I)所述外源基因表达单元的序列包括 5’至3’方向依次排列的启动子序列、外源基因序列以及终止信号和polyA加尾信号序列。
10.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤2)具体为:重组质粒转化CHO细胞后，通过MSX进行加压筛选，获得稳定表达的细胞株。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述MSX加压筛选的终浓度为10~ 100 μ molο
12.权利要求1-4任一权利要求所述pHLXlOl真核表达载体和/或权利要求5_6任一权利要求所述PHLX101-CH0真核表达系统在重组蛋白表达中的应用。
【文档编号】C12N15/85GK103509823SQ201210211812
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月25日 优先权日:2012年6月25日
【发明者】姜伟东, 郎国竣, 王彦玲, 陈莹, 刘世高, 郭新军, 马辰, 张二辉 申请人:上海复宏汉霖生物技术有限公司