专利名称：变体枯草杆菌蛋白酶(枯草杆菌酶)的制作方法
技术领域：
本发明涉及对污溃，尤其卵污溃具有改良性能的新枯草杆菌酶(subtilase)。当这些枯草杆菌酶用于如清洁或洗涤剂组合物，如洗衣组合物和洗盘组合物中，包括自动洗盘组合物中时，对卵污溃表现出优良的或改进的性能。本发明也涉及编码该枯草杆菌酶的分离的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、包含该核酸构建体的宿主细胞，以及生产和使用本发明的枯草杆菌酶的方法。而且,本发明涉及包含本发明枯草杆菌酶的清洁和洗涤剂组合物，以及这些酶在洗涤剂组合物中的用途 和用于除去卵污溃的用途。
背景技术：
在洗涤剂工业，酶已在洗涤配方中使用了 30年以上。用于这些配方的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶和其它酶或它们的混合物。商业上最为重要的酶是蛋白酶。数量不断增长的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体，如 DURAZYM (Novozymes A/S)、RELASE (NovozymesA/S)、MAXAPEM (Gist-Brocades N. V.) >PURAFECT (Genencor International, Inc.)。此夕卜，本领域，如EP130756 (GENENTECH)(对应于美国重新发行(Reissue)专利号 34，606 (GENENCOR));EP 214435 (HENKEL) ;W087/04461 (AMGEN) ;W087/05050(GENEX);EP 260105(GENENCOR);Thomas, Russell,和 Fersht(1985)Nature318375-376;Thomas, Russell,和 Fersht(1987)J. Mol. Biol. 193 803-813;Russel和 Fersht Nature 328496-500 (1987) ;W0 88/08028 (Genex) ;W088/08033 (Amgen) ;W0 95/27049 (S0LVAY S.A.) ;WO 95/30011 (PROCTER&GAMBLE COMPANY) ;WO95/30010 (PROCTER&GAMBLE COMPANY) ;W095/29979 (PR0CTER&GAMBLEC0MPANY) ;US 5.543.302 (S0LVAY S.A.) ;EP 251446 (GENENCOR) ;W089/06279 (NOVOZYMES A/S);W091/00345(NOVOZYMES A/S);EP 525610A1(SOLVAY);W0 94/02618(GIST-BROCADESN. V.)中描述了许多蛋白酶变体。在WO 02/42740 (NOVOZYMES A/S)中描述了用于筛选(AMSA)的试验方法。WO 01/75087 (MAXYGEN, INC. /NOVOZYMES A/S)描述了枯草杆菌蛋白酶同系物，其改进了多种特定性质，包括热稳定性、低温下的活性和碱性稳定性。WO 01/68821 (NOVOZYMES A/S)描述了枯草杆菌酶，其适于从例如衣物和/或硬表面除去卵污溃。然而,尽管已经描述了许多有用的蛋白酶和蛋白酶变体,仍然需要对许多工业用途进一步改进蛋白酶或蛋白酶变体。具体地，由于存在于卵白中的物质抑制许多丝氨酸蛋白酶这一事实，从例如衣物或者硬表面除去卵污溃的问题已经变得突出。因此，本发明的一个目的是提供改良的枯草杆菌酶，其适于例如从衣物或者硬表面除去卵污溃。发明概述从而，一方面，本发明涉及对卵污溃具有改良的洗涤性能的枯草杆菌酶，所述枯草杆菌酶选自(a)枯草杆菌酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269所示氨基酸序列具有99. 26%以上同一性；和
(b)枯草杆菌酶，其由克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)MT173 DSM15575中存在的质粒片段的编码枯草杆菌酶的多核苷酸部分编码，或者与所述枯草杆菌酶具有至少99. 26%同一性的所述枯草杆菌酶的变体；和(C)枯草杆菌酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO:4的氨基酸I到269所示氨基酸序列具有97. 40%以上同一性；和(d)枯草杆菌酶，其由克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒片段的编码枯草杆菌酶的多核苷酸部分编码，或者与所述枯草杆菌酶具有97. 40%以上同一性的所述枯草杆菌酶的变体。在第二方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其含有编码本发明的枯草杆菌酶的核酸序列。在第三方面，本发明涉及编码枯草杆菌酶的分离的多核苷酸，其选自(a)与SEQ ID NO: I的核苷酸I到807所示核酸序列具有至少88%同一性的多核苷酸；和(b)已经克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15575中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分，或者所述核酸序列的与该核酸序列具有至少88%同一性的变体，(c)与SEQ ID NO: 3的核苷酸I到807所示核酸序列具有至少88%同一性的多核苷酸；和Cd)已经克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分，或者所述核酸序列的与该核酸序列具有至少88%同一性的变体。在第四方面，本发明涉及核酸构建体，其含有根据本发明的核酸序列，其有效连接到指导枯草杆菌酶在适宜的宿主中表达的一个或多个控制序列。在第五方面，本发明涉及重组表达载体，其含有根据本发明的核酸构建体、启动子、转录和翻译终止信号。在第六方面，本发明涉及重组宿主细胞，其含有本发明的核酸构建体。在第七方面，本发明涉及产生根据本发明的枯草杆菌酶的方法，该方法包括(a)在有助于产生枯草杆菌酶的条件下培养重组宿主细胞；和(b)回收枯草杆菌酶。在第八方面，本发明涉及清洁或洗涤剂组合物，优选洗衣和洗盘组合物，其含有本发明的枯草杆菌酶。本发明还涉及I.枯草杆菌酶，其选自
(a)枯草杆菌酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269所示氨基酸序列具有99. 26%以上同一性；或(b)枯草杆菌酶，其由克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)MT173DSM 15575中存在的质粒片段的编码枯草杆菌酶的多核苷酸部分编码，或者与所述枯草杆菌酶具有99. 26%以上同一丨I"生的所述枯草杆菌酶的变体；或(c)枯草杆菌酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO: 4的氨基酸I到269所示氨基酸序列具有97. 40%以上同一性；或(d)枯草杆菌酶，其由克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒片段的编码枯草杆菌酶的多核苷酸部分编码，或者与所述枯草杆菌酶具有97. 40%以上同一性的所述枯草杆菌酶的变体。 2.根据项I的枯草杆菌酶,其具有I)与Ia)或者Ib)中描述的氨基酸序列具有99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的氨基酸序列；或者II)与Ic)或者Id)中描述的氨基酸序列具有97. 40%以上，或者97. 77%以上，或者98. 14%以上，或者98. 51%以上，或者98. 89%以上，或者99. 26%以上，或者99. 63%以上
同一性的氨基酸序列。3.根据项2的枯草杆菌酶，其由SEQ ID NO:2的氨基酸I到269所示氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO: 4的氨基酸I到269所示氨基酸序列组成。4.根据项I的枯草杆菌酶,其具有I)与克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15575中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶具有99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的氨基酸序列；或者II)与克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶具有97. 40%以上，或者97. 77%以上，或者98. 14%以上，或者98. 51%以上，或者98. 89%以上，或者99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的氨基酸序列。5.根据项4的枯草杆菌酶，其由I)克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15575中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶；或II)克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶组成。6.前面项任意一项的枯草杆菌酶,其中所述枯草杆菌酶是I)具有如SEQ ID NO:2的氨基酸I到269所示氨基酸序列的枯草杆菌酶变体，其含有一个或多个氨基酸残基替换、缺失和/或插入；或II)具有如SEQ ID NO: 4的氨基酸I到269所示氨基酸序列的枯草杆菌酶变体，其含有一个或多个氨基酸残基替换、缺失和/或插入。7.根据项6的枯草杆菌酶，其含有如下位置之一的至少一种修饰27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252 和 274 (BASBPN 编号)。
8.根据项I的枯草杆菌酶，其中所述修饰选自K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和 T274A (BASBPN 编号)。9.分离的多核苷酸,其含有编码项I 一 8任意一项中定义的枯草杆菌酶的多核苷酸。10.分离的多核苷酸，其编码枯草杆菌酶，所述多核苷酸选自(a)与SEQ ID NO: I的核苷酸I到807所示多核苷酸具有至少88%同一性的多核苷酸；或(b)已经克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15575中存在的质粒的多核 苷酸的枯草杆菌酶编码部分，或者所述核酸序列的与该核酸序列具有至少88%同一性的变体，(c)与SEQ ID NO: 3的核苷酸I到807所示多核苷酸具有至少88%同一性的多核苷酸；或(d)已经克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分，或者所述核酸序列的与该核酸序列具有至少88%同一性的变体。11.根据项10的多核苷酸，其具有I)与SEQ ID NO: I的核苷酸I到807所示的多核苷酸具有至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列；或II)与SEQ ID NO: 3的核苷酸I到807所示的多核苷酸具有至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的核酸序列。12.根据项10的多核苷酸，其具有I)与已经克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15575中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分具有至少89 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列；或II)与已经克隆到大肠杆菌MT173 DSM 15574中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分具有至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %同一性的核酸序列。13.核酸构建体，其含有项9 一 12任意一项的核酸序列，所述核酸序列与指导枯草杆囷酶在适宜宿王中表达的一种或多种控制序列有效连接。14.重组表达载体，其含有项13的核酸构建体、启动子、转录和翻译终止信号。15.重组宿主细胞，其含有项13的核酸构建体。16.根据项15的宿主细胞，其是细菌，优选芽孢杆菌属，特别是迟缓芽孢杆菌。17.根据项15的宿主细胞，其是真菌或酵母，优选丝状真菌，特别是曲霉属。18.产生根据项I 一 8任意一项的枯草杆菌酶的方法，该方法包括(a)在有助于产生枯草杆菌酶的条件下培养项15 — 17任意一项中定义的重组宿主细胞；和(b)回收枯草杆菌酶。19.清洁或洗涤剂组合物，优选洗衣或洗盘组合物，其含有根据项I 一 8任意一项的枯草杆菌酶。20.根据项19的组合物，其还含有纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、其他蛋白酶、淀粉酶或者它们的混合物。21.项I 一 8任意一项中定义的枯草杆菌酶的用途，用于清洁或洗涤剂组合物中。22.项I 一 8任意一项中定义的枯草杆菌酶的用途，用于除去卵污溃。23.项19 - 20任意一项中定义的清洁或洗涤剂组合物的用途，用于除去卵污溃。24.清洁或盘洗涤的、洗涤硬表面或者衣物的方法，所述方法包括将硬表面或者衣物与项19 - 20中定义的组合物接触。25.从硬表面或者衣物除去卵污溃的方法，所述方法包括将含有卵污溃的硬表面或者含有卵污溃的衣物与项19 - 20中定义的组合物接触。本发明的其他方面涉及本发明的枯草杆菌酶用于清洁或洗涤剂组合物中的用途；本发明的枯草杆菌酶或组合物用于除去卵污溃的用途；清除或洗涤的方法，其包括从硬表面或者衣物除去卵污溃的方法，该方法包括将硬表面或者衣物与本发明的组合物接触。图I进行了相关比对和编号参考，所述图I显示了枯草杆菌蛋白酶BPN’ (a)(BASBPN)和本发明的新的枯草杆菌酶(b)和(c)之间的比对。
这些比对在本专利申请中用作对残基编号的参照。定义在更详细地讨论本发明之前，首先定义以下的术语和惯用语。氨基酸命名法A=Ala=丙氨酸V=Val=缬氨酸L=Leu=亮氨酸I=Ile=异亮氨酸P=Pro=脯氨酸F=Phe=苯丙氨酸W=Trp=色氨酸M=Met=甲硫氨酸G=Gly=甘氨酸S=Ser=丝氨酸T=Thr=苏氨酸C=Cys=半胱氨酸Y=Tyr=酪氨酸N=Asn=天冬酰胺Q=Gln=谷氨酰胺D=Asp=天冬氨酸E=Glu=谷氨酸K=Lys=赖氨酸R=Arg=精氨酸H=His=组氨酸
X=Xaa=任意氨基酸核酸命名法A=腺嘌呤G=鸟嘌呤C=胞嘧啶T=胸腺嘧啶(仅在DNA中)U=尿嘧啶(仅在RNA中)变体命名的命名法和惯用语 在描述本发明的产生的或期待的多种枯草杆菌酶变体时，采用以下的命名法和惯用语以易于参照首先通过将分离的或亲本酶与枯草杆菌蛋白酶BPN’ (BASBPN)对比来定义参考框。在本发明上下文中，“同源性”或“同源的”以其常规意思理解，两种氨基酸序列之间的“同源性，，用 University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG)包的GAP程序，对比对参数、比较矩阵、缺口和缺口延伸罚分使用默认设置定义的“相似性”来确定。缺口(GAP)罚分的默认值即缺口产生罚分3. 0，缺口延伸罚分0. I(Wisconsin Package,版本 8,1994 年 8 月的程序手册，Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)。该方法还描述于 S. B. Needleman 和C. D. ffunsch, Journal of Molecular Biology, 48，443-445 (1970)。可以从相同计算提取同一性。两种氨基酸序列之间同源性还可以用GCG包9. I版的GAP常规方法，对比对参数、t匕较矩阵使用默认参数通过“同一性”或者“相似性”确定，还可以应用缺口和缺口延伸罚分，使用下面的参数缺口产生罚分=8，缺口延伸罚分=8并且所有其他参数保持默认值。除了氨基酸比对，该方法还输出两条序列之间“同一性百分率”和“相似性”的计算。使用GCG软件包9. I版计算的数目与8. 0计算的略有不同。另一种方法是使用公知的枯草蛋白酶之间的比对，如WO 91/00345中指出的比对。在多数情况中，方法之间差异将不重要。枯草杆菌蛋白酶BPN’ (BASBPN)和本发明的新枯草杆菌酶之间的序列对比如图I所示。因此，将定义许多与BASBPN相关的缺失和插入。在图I中，本发明的新枯草杆菌酶与BASBPN相比，在36、58、158、162、163和164位有6处缺失。这些缺失在图I中由星号0)表示。一般采用以下的三个成分来表示对亲本酶所进行的多种修饰原始氨基酸位置替换的氨基酸符号G195E意指195位的甘氨酸被谷氨酸替换。位置替换的氨基酸在原始氨基酸残基可以是任意氨基酸残基的情况下，有时可以用简略表达方式仅表示位置和替换的氨基酸170Ser或者170S。这种符号尤其与同源枯草杆菌酶的修饰相关(见下文)。原始氨基酸位置
当鉴定替换氨基酸残基不重要时，这种符号尤其相关。用任意氨基酸残基替换195位的甘氨酸表示为Glyl95或者G195。位置当原始氨基酸和替换氨基酸均可以包含任意氨基酸时，则只指出位置，如170。原始氨基酸位置{替换的氨基酸y ...，替换的氨基酸J当原始氨基酸和/或替换的氨基酸可以包含一种以上但不是所有的氨基酸时，所选择的氨基酸表不在括号{}内对于特定的变体,使用特定的三个或一个字母代码,包括代码Xaa和X用来表示任何氨基酸残基。
替换用谷氨酸替换195位的甘氨酸表示为Glyl95Glu 或 G195E或者用任意氨基酸残基酸替换195位的甘氨酸表示为Glyl95Xaa 或 G195X或Glyl95 或 G195因此用丝氨酸替换170位的任意氨基酸残基表示为Xaal70Ser 或 X170S或170Ser 或 170S这种符号尤其与同源枯草杆菌酶的修饰相关(见下文)。因此170Ser意指包含例如BASBPN中的Lysl70Ser修饰和本发明枯草杆菌酶的Argl70Ser的修饰(参见图I)。对于其中的原始氨基酸和/或替换的氨基酸可以包含一种以上但不是所有的氨基酸的修饰而言，由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸替换170位的精氨酸表示为Argl70 {Gly, Ala, Ser, Thr}或 R170 {G, A, S, T}以表示变体R170G、R170A、R170S 和 R170T。缺失195位甘氨酸的缺失表示为Glyl95* 或 G195*相应地，一个以上氨基酸残基的缺失，如195和196位甘氨酸和亮氨酸的缺失表示为Gly195*+Leul96* 或 G195*+L196*插入额外的氨基酸残基的插入，如在G195后插入赖氨酸表示为Glyl95GlyLys 或 G195GK ；或者，当插入一个以上的氨基酸残基，如在G195后插入Lys和Ala时，这种插入表示为Glyl95GlyLysAla 或 G195GKA
在这些情况下，通过将小写字母加到插入氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置号来对插入氨基酸残基进行编号。在以上的实施例中，序列194-196因此为194 195 196BLSAVI A-G-L194 195 195a 195b 196变体A-G-K-A-L当插入与所存在的氨基酸残基相同的氨基酸残基时，显然是在命名中出现了简并。如果例如在以上的实施例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，则将它表示为G195GG。对从194 195 196 BLSAVI A-G-L194 195 195a 196至变体A-G-G —L194 194a 195 196的同一现行变化还可以表示为A194AG。这些例子对本领域技术人员来说是显而易见的，且表示法G195GG和这种类型插入的相应表示法因此是指包含此类等同的简并表示法。填补缺口 当与用于编号的枯草杆菌蛋白酶BPN’序列进行比较，在参照的酶中存在缺失时，则对于在36位天冬氨酸的插入而言，这种位置处的插入表示为*36Asp 或 *36D多重修饰用加号分隔含多重修饰的变体，如Argl70Tyr+Glyl95Glu 或 R170Y+G195E代表在170和195位分别用酪氨酸和谷氨酸替换精氨酸和甘氨酸的修饰。因此，Tyrl67{Gly, Ala, Ser, Thr} +Argl70 {Gly, Ala, Ser, Thr}表不以下变体Tyrl67Gly+Argl70Gly, Tyrl67Gly+Argl70Ala,Tyrl67Gly+Argl70Ser, Tyrl67Gly+Argl70Thr,Tyrl67Ala+Argl70Gly, Tyrl67Ala+Argl70Ala,Tyrl67Ala+Argl70Ser, Tyrl67Ala+Argl70Thr,Tyrl67Ser+Argl70Gly, Tyrl67Ser+Argl70Ala,Tyrl67Ser+Argl70Ser, Tyrl67Ser+Argl70Thr,Tyrl67Thr+Argl70Gly, Tyrl67Thr+Argl70Ala,Tyrl67Thr+Argl70Ser 和 Tyrl67Thr+Argl70Thr。这种命名法与针对替换、取代、插入或缺失具有特定共同性质的氨基酸残基，如带正电荷(K、R、H)、带负电荷(D、E)的残基的修饰，或用一种小氨基酸替换另一种小氨基酸的诸如 Tyrl67 {Gly, Ala, Ser, Thr} +Argl70 {Gly, Ala, Ser, Thr}的保守氨基酸的修饰特别相关。进一步的详细描述参见“发明详述”部分。蛋白酶分解蛋白质底物中的酰胺键的酶归类为蛋白酶，或(可互换地)肽酶(见Walsh, 1979,酶反应机理(Enzymatic Reaction Mechanisms). ff. H. Freeman andCompany, San Francisco,第 3 章)。氨基酸位置/残基的编号如果没有另外指出，本文所用的氨基酸编号对应于枯草杆菌酶BPN’ (BASBPN)序列的氨基酸编号。对BPN’序列的详细描述,参见图I或Siezen等人，蛋白质工程(ProteinEngng. ) 4(1991)719-737。丝氡酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶是一种催化肽键水解的酶，其中在活性部位存在必需的丝氨酸残基(White, Handler 和 Smith, 1973 “生物化学原理(Principles of Biochemistry)，” 第五版，McGraw-Hill Book 公司，纽约，第 271-272 页)。细菌丝氨酸蛋白酶的分子量在20，000-45，000道尔顿的范围内。它们被二异 丙基氟代磷酸酯抑制。它们水解简单末端脂类，且其活性与真核生物糜蛋白酶(也是一种丝氨酸蛋白酶)相似。一个更为狭义的术语包括在一个亚组的碱性蛋白酶反映某些丝氨酸蛋白酶的高pH最佳值，为pH 9. 0-11.0(综述参见Priest (1977)细菌学评论(Bacteriological Rev. ) 41 :711-753)。枯草杆菌酶Siezen等人提出丝氨酸蛋白酶的一个亚组,其暂称为枯草杆菌酶(subtilase)，见蛋白质工程，4 (1991) 719-737和Siezen等人，蛋白质科学(Protein Science)6 (1997) 501-523。它们是通过对170多个先前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列进行同源性分析而定义的。枯草杆菌蛋白酶以前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据Siezen等人则为枯草杆菌酶的一个亚组。已鉴定了大量的枯草杆菌酶，并已测定了一些枯草杆菌酶的氨基酸序列。对此类枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细描述参见Siezen等人(1997)。枯草杆菌酶的一个亚组，I-Sl或〃真〃枯草杆菌蛋白酶，包含“标准的”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg ( ALCALASE , Novozymes A/S)和枯草杆菌蛋白酶 DY (BSSDY)。Siezen等人(见上文)识别了枯草杆菌酶的另一亚组，I_S2或强碱性枯草杆菌蛋白酶。亚组I-S2蛋白酶被描述为强碱性枯草杆菌蛋白酶并包括枯草杆菌蛋白酶 PB92 (BAALKP) ( MAXACAL , Gist-BrocadesNV)、枯草杆菌蛋白酶 309 (BLSAVI)
(SAVINASE , Novozymes A/S)、枯草杆菌蛋白酶 147 (BLS147) ( ESPERASE ,Novozymes A/S)和喊性弹性蛋白酶 YaB (BSEYAB)。亲本枯草杆菌酶术语“亲本枯草杆菌酶”描述一种根据Siezen等人(1991和1997)定义的枯草杆菌酶。关于进一步的细节，参见上述对“枯草杆菌酶”的描述。亲本枯草杆菌酶也可以是从天然来源分离的枯草杆菌酶，其中，在保持枯草杆菌酶特性的情况下经过进一步修饰。而且，亲本枯草杆菌酶还可以是通过如以下文献所述的DNA改组技术制备的枯草杆菌酶J. E. Ness 等人，自然生物技术(Nature Biotechnology) , 17, 893-896 (1999)。术语“亲本枯草杆菌酶”可另外称为“野生型枯草杆菌酶”。
枯草杆菌酶的修饰本文所用的术语“修饰”定义为包括枯草杆菌酶的化学修饰以及对编码枯草杆菌酶的DNA所进行的遗传操作。修饰可以是氨基酸侧链的取代、目标氨基酸处的替换、缺失和/或插入。枯草杆菌酶变体在本发明的上下文中，术语枯草杆菌酶变体或突变的枯草杆菌酶指由表达突变基因的生物体产生的枯草杆菌酶,该突变基因来源于含原始或亲本基因并产生相应亲本酶的亲本微生物，所述亲本基因已发生突变以产生突变基因，这种突变基因在适宜的宿主中表达时产生所述的突变枯草杆菌酶。类似地,所述突变基因还可以来自通过DNA改组技术产生的未本基因。同源枯草杆菌酶序列
在本上下文中，两种氨基酸序列之间的同源性用参数“同一性”描述。为了确定两种枯草杆菌酶之间的同一性程度，可以使用相同的设置应用(下文)GCG程序包9. I版的GAP方法。此方法的计算结果除了氨基酸序列对比外，还有两个序列之间的“同一性百分率”的计算结果。根据此说明，本领域技术人员可常规地鉴定适宜的同源性枯草杆菌酶和相应的同源活性部位环区，它们可以根据本发明进行修饰。分离的多核苷酸本文所用的术语“分离的多核苷酸”指经分离和纯化并因此为适用于遗传工程化的蛋白质产生体系的形式的多核苷酸。这些分离的分子可以从其自然环境中分离，并包括cDNA和基因组克隆以及来自DNA改组实验或定点突变实验的多核苷酸。本发明的分离的多核苷酸不含其它通常与之相关的基因，但可包括5’和3’非翻译区如启动子和终止子。相关区域的鉴定对本领域技术人员来说是显而易见的(例如，参见Dynan和Tijan,自然316:774-78，1985)。术语“分离的核酸序列”另外可称为“分离的DNA序列”、“克隆的核酸序列”或“克隆的DNA序列”。分离的蛋白质术语“分离的”在应用于蛋白质时指此蛋白质已从其自然环境中分离出。在优选的形式中，分离的蛋白质基本上不含其它蛋白质，特别是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(参见以下))。通过SDS-PAGE测定分离的蛋白质的纯度大于10%，优选大于20%，更优选大于30%。还优选提供通过SDS-PAGE测定纯度大于40%，大于60%，大于80%，更优选大于95%，并最优选大于99%的高度纯化形式的蛋白质。术语“分离的蛋白质”可另称为“纯化的蛋白质”。同源杂质术语“同源杂质”意指任何来源于最初获得本发明枯草杆菌酶的同源细胞的杂质(如除了本发明枯草杆菌酶之外的另一多肽)。自……获得本文所用与特定的微生物源相关的术语“自……获得”意指该多核苷酸和/或枯草杆菌酶是由特定来源或由细胞产生，其中所述细胞中已插入来自于所述来源的基因。
底盤本文所用的与蛋白酶的底物相关的术语“底物”应以其最广义的形式解释为包括含有至少一个易于被枯草杆菌蛋白酶水解的肽键的化合物。产物本文所用的与来自蛋白酶酶促反应的产物有关的术语“产物”在本发明的上下文中应解释为包括涉及蛋白酶枯草杆菌酶的水解反应的产物。产物可以是在随后的水解反应中的底物。洗涤性能在本发明上下文中，术语“洗涤性能”用作酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中除去存在于目标上的污溃，尤其卵污溃至清洁的能力。还参见实施例2中的“标准的洗涤剂洗涤性能试验”。 %除去的蛋白质膜在本发明上下文中，术语除去的蛋白质膜”用作酶在自动洗盘期间除去所要清洗的目标上存在的污溃，尤其卵污溃的能力。性能数据来自干净、脏的和洗过的钢盘的重力测量
权利要求
1.枯草杆菌酶用于除去卵污溃的用途，所述枯草杆菌酶为氨基酸序列为SEQID NO:2的氨基酸I到269所示的枯草杆菌酶或者在SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269中经过替换一个或多个氨基酸而由SEQ ID N0:2的氨基酸I到269衍生的枯草杆菌酶，其显示出改进的洗涤性能，其中所述替换选自根据BASBPN编号的如下位置27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、.100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、.252 和 274。
2.根据权利要求I的枯草杆菌酶的用途，其中所述替换选自根据BASBPN编号的K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和 T274A。
3.清洁或盘洗涤的、洗涤硬表面或者衣物的方法，所述方法包括将硬表面或者衣物与清洁或洗涤剂组合物接触，所述清洁或洗涤剂组合物包含氨基酸序列为SEQ ID NO:2的氨基酸I到269所示的枯草杆菌酶或者在SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269中经过替换一个或多个氨基酸而由SEQ ID NO:2的氨基酸I到269衍生的枯草杆菌酶，其显示出改进的洗涤性能，其中所述替换选自根据BASBPN编号的如下位置27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、.100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、.252 和 274。
4.根据权利要求3的方法，其中所述替换选自根据BASBPN编号的K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和T274A。
5.从硬表面或者衣物除去卵污溃的方法，所述方法包括将含有卵污溃的硬表面或者含有卵污溃的衣物与清洁或洗涤剂组合物接触，所述清洁或洗涤剂组合物包含氨基酸序列为SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269所示的枯草杆菌酶或者在SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269中经过替换一个或多个氨基酸而由SEQ ID NO: 2的氨基酸I到269衍生的枯草杆菌酶，其显示出改进的洗涤性能，其中所述替换选自根据BASBPN编号的如下位置27、36、56、76、87、95、.96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、232、235、.236、245、248、252 和 274。
6.根据权利要求5的方法，其中所述替换选自根据BASBPN编号的K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和T274A。
7.枯草杆菌酶，其选自 (a)枯草杆菌酶，其氨基酸序列与SEQID NO: 2的氨基酸I到269所示氨基酸序列具有.99. 26%以上同一性；或 (b)枯草杆菌酶，其由克隆到大肠杆菌(Escherichiacoli)MT173DSM 15575中存在的质粒片段的编码枯草杆菌酶的多核苷酸部分编码，或者与所述枯草杆菌酶具有99. 26%以上同一'I"生的所述枯草杆菌酶的变体；或 (c)枯草杆菌酶，其氨基酸序列与SEQID NO: 4的氨基酸I到269所示氨基酸序列具有.97.40%以上同一性；或 (d)枯草杆菌酶，其由克隆到大肠杆菌MT173DSM 15574中存在的质粒片段的编码枯草杆菌酶的多核苷酸部分编码，或者与所述枯草杆菌酶具有97. 40%以上同一性的所述枯草杆菌酶的变体。
8.根据权利要求7的枯草杆菌酶，其具有 I)与Ia)或者Ib)中描述的氨基酸序列具有99.26%以上，或者99. 63%以上同一性的氨基酸序列；或者 II)与Ic)或者Id)中描述的氨基酸序列具有97.40%以上，或者97. 77%以上，或者.98.14%以上，或者98. 51%以上，或者98. 89%以上，或者99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求8的枯草杆菌酶，其由SEQID NO:2的氨基酸I到269所示氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:4的氨基酸I到269所示氨基酸序列组成。
10.根据权利要求7的枯草杆菌酶，其具有 I)与克隆到大肠杆菌MT173DSM15575中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶具有99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的氨基酸序列；或者 II)与克隆到大肠杆菌MT173DSM15574中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶具有97. 40%以上，或者97. 77%以上，或者98. 14%以上，或者.98. 51%以上，或者98. 89%以上，或者99. 26%以上，或者99. 63%以上同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求10的枯草杆菌酶,其由 I)克隆到大肠杆菌MT173DSM15575中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶；或 II)克隆到大肠杆菌MT173DSM15574中存在的质粒片段的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分编码的枯草杆菌酶组成。
12.前面权利要求任意一项的枯草杆菌酶，其中所述枯草杆菌酶是 I)具有如SEQID NO:2的氨基酸I到269所示氨基酸序列的枯草杆菌酶变体，其含有一个或多个氨基酸残基替换、缺失和/或插入；或 II)具有如SEQID N0:4的氨基酸I到269所示氨基酸序列的枯草杆菌酶变体，其含有一个或多个氨基酸残基替换、缺失和/或插入。
13.根据权利要求12的枯草杆菌酶，其含有如下位置之一的至少一种修饰27、36、56、.76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、159、167、170、206、218、222、224、.232、235、236、245、248、252 和 274 (BASBPN 编号)。
14.根据权利要求13的枯草杆菌酶，其中所述修饰选自K27R、*36D、S56P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、G159D、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K 和 T274A (BASBPN编号)。
15.分离的多核苷酸,其含有编码权利要求7— 14任意一项中定义的枯草杆菌酶的多核苷酸。
16.分离的多核苷酸，其编码枯草杆菌酶，所述多核苷酸选自 (a)与SEQ ID NO: I的核苷酸I到807所示多核苷酸具有至少88%同一性的多核苷酸；或 (b)已经克隆到大肠杆菌MT173DSM15575中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分，或者所述核酸序列的与该核酸序列具有至少88%同一性的变体， (c)与SEQID NO: 3的核苷酸I到807所示多核苷酸具有至少88%同一性的多核苷酸；或 (d)已经克隆到大肠杆菌MT173DSM15574中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分，或者所述核酸序列的与该核酸序列具有至少88%同一性的变体。
17.根据权利要求16的多核苷酸，其具有 I)与SEQID NO: I的核苷酸I到807所示的多核苷酸具有至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列；或 II)与SEQID NO:3的核苷酸I到807所示的多核苷酸具有至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的核酸序列。
18.根据权利要求16的多核苷酸，其具有 I)与已经克隆到大肠杆菌MT173DSM15575中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分具有至少89 %、至少90 %、至少91%、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列；或 II)与已经克隆到大肠杆菌MT173DSM15574中存在的质粒的多核苷酸的枯草杆菌酶编码部分具有至少89 %、至少90 %、至少91%、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核酸序列。
19.核酸构建体，其含有权利要求15- 18任意一项的核酸序列，所述核酸序列与指导枯草杆菌酶在适宜宿主中表达的一种或多种控制序列有效连接。
20.重组表达载体，其含有权利要求19的核酸构建体、启动子、转录和翻译终止信号。
21.重组宿主细胞,其含有权利要求19的核酸构建体。
22.根据权利要求21的宿主细胞，其是细菌，优选芽孢杆菌属，特别是迟缓芽孢杆菌。
23.根据权利要求21的宿主细胞，其是真菌或酵母，优选丝状真菌，特别是曲霉属。
24.产生根据权利要求7— 14任意一项的枯草杆菌酶的方法,该方法包括 (a)在有助于产生枯草杆菌酶的条件下培养权利要求21— 23任意一项中定义的重组宿主细胞；和 (b)回收枯草杆菌酶。
25.清洁或洗涤剂组合物，优选洗衣或洗盘组合物，其含有根据权利要求7— 14任意一项的枯草杆菌酶。
26.根据权利要求25的组合物，其还含有纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、其他蛋白酶、淀粉酶或者它们的混合物。
27.权利要求7— 14任意一项中定义的枯草杆菌酶的用途，用于清洁或洗涤剂组合物中。
28.权利要求7— 14任意一项中定义的枯草杆菌酶的用途，用于除去卵污溃。
29.权利要求25- 26任意一项中定义的清洁或洗涤剂组合物的用途，用于除去卵污溃。
30.清洁或盘洗涤的、洗涤硬表面或者衣物的方法，所述方法包括将硬表面或者衣物与权利要求25 - 26中定义的组合物接触。
31.从硬表面或者衣物除去卵污溃的方法，所述方法包括将含有卵污溃的硬表面或者含有卵污溃的衣物与权利要求25 - 26中定义的组合物接触。
全文摘要
对卵污渍具有改良的洗涤性能的新的枯草杆菌酶。这些枯草杆菌酶当用于例如清洁或洗涤剂组合物，如洗衣组合物和洗盘组合物，包括自动洗盘组合物中时对卵污渍具有优秀的或者改进的洗涤性能。
文档编号C12N9/52GK102766545SQ20121021350
公开日2012年11月7日 申请日期2004年5月6日 优先权日2003年5月7日
发明者J.C.F.克内泽, J.E.内斯, J.S.米舒尔, J.彻丽, L.J.吉韦尔, M.D.韦尔奇, N.H.泽伦森, S.米宁, T.维德尔博尔歇特 申请人:诺维信公司, 麦克西根公司