专利名称：一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种嗜热酸性普鲁兰酶及其制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
嗜热细菌是一类可以在55°C以上环境温度中生长繁殖的微生物，根据其最适生长温度的不同，可以分为嗜热菌(55-80°C)和超嗜热菌(80-110°C)。由于具有良好的热稳定性和嗜热性，来源于嗜热细菌的酶被称为嗜热酶。嗜热酶不仅具有高效的反应催化活性，而且在高温下能够保持很高的稳定性，对有机溶剂及变性剂也有很强的抗性，因此是生物催 化领域近年来发现重要的新型生物催化剂，广泛应用于食品工业、环境保护、能源以及石油开采等工业生物技术方面。迄今已有嗜热蛋白酶，淀粉酶，木聚糖酶，纤维素酶等嗜热酶投入工业应用，尤其是来源于水生栖热菌Thermus Aquaticus的DNA聚合酶(Taq酶)在PCR技术中的广泛应用，使得该技术在生物研究和医疗领域都实现了新的飞跃。普鲁兰酶(EC 3. 2. I. 41)属于淀粉水解酶，能够专一性水解普鲁兰多糖、糖原、淀粉、支链淀粉和相应低聚糖中α-1，6糖苷键的脱枝酶。普鲁兰酶与α-淀粉酶、β -淀粉酶或糖化酶共同作用可将淀粉彻底水解为葡萄糖，因此广泛应用于以淀粉为原料的食品深加工、酿造、医药和新生物质能源等工业部门。根据水解的糖苷键差异分为I型(专一性水解普鲁兰的α-1，6_糖苷键)和II型(可水解普鲁兰的α-1，6_糖苷键以及其他多聚糖的^1-1，4_糖苷键)两种。嗜热细菌Iettingae ΤΜ0)是一类嗜高温的、无芽孢的严格厌氧菌，其最适生长温度为65°C,最适pH在7. O左右。T. Iettingae能够分解和利用淀粉、纤维素和半纤维素等多聚糖，是嗜热淀粉酶和纤维素酶的理想来源。目前已经有一些嗜热酶从该菌中分离得到，比如葡聚糖酶，乙醇脱氢酶，肽酶等。这些酶在工业，纺织，食品以及生物工程领域都具有很好的应用前景。到目前为止，全世界上只有丹麦NOVO和美国杰能科两家公司具备普鲁兰酶工业化生产能力，生产水平在100-400 U/mL(发酵液)。普鲁兰酶对于淀粉支链的水解具有重要作用，然而由于其特殊定位以及复杂的分泌系统，为工业化生产带来障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种嗜热温酸性普鲁兰酶及其制备方法和应用。本发明的技术方案是一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，它的步骤如下
(O设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物，引物的序列如下
上游引物 Pl :5' - GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC-3'；
下游引物 P2:5' - GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC-3'；
(2)PCR扩增及重组质粒的构建
以嗜热细菌全基因组序列为模板进行扩增，PCR扩增条件如下94°C预变性5 min；94°C 30 s，53°C 30 s，72°C 2 min，30个循环，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌疋coli DH5 α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证；
(3)基因的诱导表达与蛋白质的纯化
将重组质粒转化疋 coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入 O. 5-1 mo I/L IPTG 于 37°C继续培养3-5 h，诱导表达的蛋白经过热处理，镍柱亲和层析，得到纯化的酶蛋白。嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备麦芽三糖中的应用。嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备单糖葡萄糖中的应用。本发明的有益效果是该酶活性最适酶活性为90°C，具有较为宽的酶适应温度，在50-100°C之间具有很高的酶活性；该酶的最适酶活pH为5. 4，具有较好的耐酸性，在高温70°C和酸性条件pH为5. O处理36小时，仍保持50%以上的活性。将该酶基因片段构建工程菌，优化发酵条件后，工程菌表达的普鲁兰酶活力达到150 U/mL以上。该酶的制备方 法，包括质粒、菌株与培养基的选择，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化，工程菌表达条件的优化。该酶具有良好的热稳定性和耐酸性，适合用于以淀粉为原料的食品深加工、酿造、医药和新生物质能源等领域。耐高温酸性普鲁兰酶应用于淀粉质原料水解，简化了淀粉加工工艺，节约酸碱化学试剂的消耗，减少工业生产对环境的污染。本发明得到了嗜热耐高温酸性普鲁兰酶的基因序列和氨基酸序列，该酶是在》Iettingae TM 中发现并制备获得的第一个普鲁兰酶；本发明获得了一种不同于已发现普鲁兰酶的新型酶资源。该嗜热普鲁兰酶具有不同的氨基酸序列和酶学特性；本发明获得了目前已发现的耐酸性最强的嗜热普鲁兰酶。
图I是蛋白质表达的电泳照片，其中I.标准蛋白质分子量；2.细胞总提取物；3.经热处理以后的粗酶提取液；4.经镍柱亲和层析纯化的酶蛋白；
图2是该酶的酶活与温度变化关系曲线；
图3是该酶的酶活与最适pH变化关系曲线；
图4是该酶的酶活与耐酸性变化关系曲线。
具体实施例方式一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，它的步骤如下
(O设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物，引物的序列如下
上游引物 Pl :5' - GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC-3'；
下游引物 P2:5' - GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC-3'；
(2)PCR扩增及重组质粒的构建
以嗜热细菌全基因组序列为模板进行扩增，PCR扩增条件如下94°C预变性5 min；94°C 30 s，53°C 30 s，72°C 2 min，30个循环，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌疋coli DH5 α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证；
(3)基因的诱导表达与蛋白质的纯化
将重组质粒转化疋 coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入 O. 5-1 mo I/L IPTG 于 37°C继续培养3-5 h，诱导表达的蛋白经过热处理，镍柱亲和层析，得到纯化的酶蛋白。嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备麦芽三糖中的应用。嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备单糖葡萄糖中的应用。一种嗜热酸性普鲁兰酶，它的核苷酸序列如下(0RF:Tlet_1262，基因序列号
NC_009828)
tcattccctg tacatcacca ttgcagatat tggcggaatt tctattgtcc cactgagttt60
gtagagaaga tctacaccag ctctttcttt atcaacgaca acattccatt cgccatcggg120
caaaatcaat tcatgttcaa cgatatctcc attgaagatc accaagatcc cttcccaggg180
gtcattgtta acatgttcat ttattaaaaa agcaacaacc ttcttcggtg attccaggaa240
agttatgtgt tttcttatat catctgccgt cctcaatcta aatgcagggt gtgattttct300
gagctttatc aatcctttgt ggtattcgaa aacatctatg aactgcgcct tcctttcata360
gtcgagcgca tttatagaaa ttggtgcatt gtacgaattt tcattgaact gtttggtcct420
gcaaaaatcc tggcctgcgt gaaagaaagg aacaccctgt gaagtgagta atatagctgc480
tgcaagtttt tgagctgact ttaattcttc ttcactccat tcccttctgt cagattttgc540
cgccagaaca tttttatccc agagtgtgtg attatcatga catgcaacat agttgatagt600
ttgttctgga ctgtaagcaa aatcagcaat caacttgttg tcatagttaa tactcccaac660
cactcctctt ttgatcttga tttctttccc cacagagccc ataacaaacc cttttgcttt720
tggatcaaaa acagagcccc ttataccgtc tcttattcca tcgttgaata cagctattct780
caaatcgaga agttgtgatt ttccaaacct tggttgaacc ccccagcctc cccacggttc840
gccatatata atcacgcttg gattaatctg tcttaaagtc ttttcaacca ttgccatggt900
ttttcggtct ataagtccca tctgatcaaa cctaaatcca tctacatgat attctttagc960
ccagtgaacg actgtatcaa gaatatatct tctcatcatg agcctttcgc tgtttgttgt1020
attgccacaa ctactttcat tcaggtattg ccccattttt ccaagcctgt aatagtaata1080
tgggactgcc tgatcaaaaa cagaaaattc tcccacacca taagtgtgtg gaaaaactac1140
atccattatc acacctatac catttttgtg aaatgtctga accattttct ttacttcata1200
gattcttgtc tttggatttg atggatctga gctgtagcag ccttctggta ccatgtaatg1260
ataaggatca tacccccagt tgtactgatt ttcgaagtct cttttcactt catcaccagt1320
gtaaaaatcg tagattggca aaatatgtac atgtgttaca ccaagttctt ttatatgttc1380
aagccctgtt gtaacgccat ttggaccgat tgtgccttct tctatcaaac caagataaga1440
cgatttgttt ttcacattac tcgtccagga gcctgtcata tctgctatgt gtatttcata1500
gattattgca tcaacataag aatcaagttt tacgtaacta tcctgttgcc aatcttctgg1560
atctgccttt ctcatgtcga cgatcgcgcc gaattttccc tgtaaagaca gcgccttggc1620
atatgggtct accccttctc tgattttgcc gtaactttcg tatcgatatc tgtaaaacca1680
tccatctaaa tctttatcaa gtcttgtata ccaaacacct ttttcatttc tttgcatatc1740
aacaacaaat gctggctgat cctgctcact tgtctgatac aatagcaact tgacagattt1800
gctgaccgga gtccatacat aaaactctgt gtattgcggt gtataaaaag ttcccagagg1860
gccatcgtag taaagctcgt ccaaaacttc taccgcataa acccttgatt tcttaaaacc1920
atctatctgt agaaaaatat ctcttgagag gtcttcttcc ttcaaaggtt gggaaagttt1980
tattctgaag taatttgtcc tggttatatc tgttgggtcg actttttcca gactgctaat2040
权利要求
1.一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，其特征在于，它的步骤如下 (O设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物，引物的序列如下 上游引物 Pl :5' - GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC-3'； 下游引物 P2:5' - GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC-3'； (2)PCR扩增及重组质粒的构建 以嗜热细菌全基因组序列为模板进行扩增，PCR扩增条件如下94°C预变性5 min；94°C 30 s，53°C 30 s，72°C 2 min，30个循环，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌疋coli DH5 α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证； (3)基因的诱导表达与蛋白质的纯化 将重组质粒转化疋 coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入 O. 5-1 mo I/L IPTG 于 37°C继续培养3-5 h，诱导表达的蛋白经过热处理，镍柱亲和层析，得到纯化的酶蛋白。
2.嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备麦芽三糖中的应用。
3.嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备单糖葡萄糖中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，它的步骤如下(1)设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物；(2)PCR扩增及重组质粒的构建；(3)基因的诱导表达与蛋白质的纯化。本发明该酶活性最适酶活性为90℃，具有较为宽的酶适应温度，在50-100℃之间具有很高的酶活性；该酶的最适酶活pH为5.4，具有较好的耐酸性，在高温70℃和酸性条件pH为5.0处理36小时，仍保持50%以上的活性。
文档编号C12N15/56GK102766644SQ201210214218
公开日2012年11月7日 申请日期2012年6月27日 优先权日2012年6月27日
发明者佘轩, 封盛雪, 魏涛 申请人:郑州轻工业学院