一种乳酸乳球菌表达载体及其制备方法与应用的制作方法

专利名称：一种乳酸乳球菌表达载体及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种可在乳酸乳球菌中分泌表达外源蛋白的表达载体，同时，还涉及一种该表达载体的构建方法与应用，尤其是应用该载体构建的表达幽门螺杆菌蛋白的重组乳酸乳球菌菌株及该菌株的应用。
背景技术：
目前研究表明对于一些人体消化道病原体感染，例如幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, H. pylori)感染，由于频繁采用抗菌素治疗可致使细菌耐药性增加、而且对重复感染无预防作用，故对这类疾病更有效的防治只能寄希望于疫苗的研究成功。在疫苗研究中，口服疫苗以其免疫途径安全、方便、合理等优点而受到关注[LevineMM. " IDEAL " vaccines for resource poor settings. Vaccine, 2011, 29Suppl4:D116-25.]。然而，缺乏安全有效的疫苗载体阻碍了口服疫苗研究发展[AgarwalK，Agarwal S. Helicobacter pylori vaccine: from past to future. Mayo ClinProc，2008，83 (2) : 169-175 ;Zhang S，Moise L, Moss SF. H. pylori vaccines:why we stilldon’t have any. Hum Vaccin, 2011，7(11): 1153-7.]。现有研究多釆用减毒伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)作为口服疫苗载体[Xu C，Li ZSj Du YQj et al. Construction of recombinant attenuated Salmonellatyphimurium DNAvaccine expressing H pylori ureB and IL-2. World J Gastroenterol，2007，13 (6) :939-944]。由于沙门氏菌属于致病菌，减毒株不仅仍具有一定的毒性，而且还存在遗传稳定性问题，应用于人体时其安全性难以保证[Lee MHj Roussel Y，WilksM，et al. Expression of Helicobacter pylori urease subunit B gene in Lactococcuslactis MG 1363and its use as a vaccine deliverysystem against H.pyloriinfection in mice. Vaccine，2001，19 (28-29) : 3927-3935];而且动物实验显示，以该菌为载体构建的抗幽门螺杆菌疫苗株用于免疫小鼠时常引发严重的免疫后胃炎，造成组织损伤。因此，有必要探讨更安全有效的口服疫苗载体。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, L. lactis)是乳酸菌类的一个菌种，在食品加工中的应用已有悠久的历史，属于食品级的益生菌，其安全性十分可靠[MorelloEj Bermudez-Humaran LG, Llull D, et al. Lactococcus lactis,an efficient cellfactory for recombinant protein production and secretion. J Mol MicrobiolBiotechnol，2008，14(1-3) :48-58];而且其生长迅速，易于培养，遗传背景和调控机制相对清楚，具有作为口服疫苗载体的很大潜力[Stentz Rj Bongaerts RJj Gunning AP,Gasson M，Shearman C. Controlled release of protein from viable Lactococcuslactis cells. Appl Environ Microbiol, 2010, 76 (9) : 3026-3031. ] 0 目前，NICE 系统是应用最为广泛的乳酸菌表达系统[Mierau I，Kleerebezem M. IOyears of thenisin-controlled gene expression system(NICE)in Lactococcus lactis. ApplMicrobiol Biotechnol, 2005，68 (6) : 705-17. ]。NICE 系统的表达载体 pNZ8149 属于食品级安全载体，不含任何抗生素抗性基因，在安全性方面的优势十分突出。近年，有将PNZ8149用于表达幽门螺杆菌抗原基因的报道[Chen S，Zhang R, Duan G, Shi J. Food-gradeexpression of Helicobacter pylori ureB subunit in Lactococcus lactis and itsimmuno-reactivity. Curr Microbiol. 2011, 62 (6) : 1726-31.]。但作为疫苗抗原表达载体，PNZ8149存在很大缺陷pNZ8149只能将外源蛋白表达于细胞质中，而无分泌表达外源蛋白的功能。乳酸乳球菌具有较厚的细胞壁，将疫苗抗原表达于胞质中，不利于疫苗抗原对胃肠黏膜免疫系统产生作用，因此会影响疫苗免疫效果。应用基因工程技术，改造PNZ8149载体，构建具有在乳酸乳球菌分泌表达外源蛋白功能的新型表达载体，并用于幽门螺杆菌尿素酶(UreB)等疫苗抗原的表达，建立更为安全有效的抗幽门螺杆菌疫苗菌株，这对幽门螺杆菌感染及相关疾病的免疫防治具有重要意 义，有望产生可观的社会和经济效益，但目前尚无报道。

发明内容
针对上述问题，本发明目的在于提供一种可在乳酸乳球菌中分泌表达外源蛋白的食品级表达载体 pNZ8149-SPusp45(SEQ ID NO. I)。同时，本发明的目的还在于提供一种该载体的构建方法。再者，本发明的目的还在于提供一种该载体的应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种乳酸乳球菌表达载体，该载体包含有如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。其含有乳酸乳球菌Usp45蛋白的信号肽基因SPusp45，SPusp45基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示，通过在所述表达载体中插入外源基因，并将载体转入乳酸乳球菌，可使SPusp45基因与外源基因在乳酸乳球菌中融合表达，进而实现外源蛋白在乳酸乳球菌中的分泌表达。本发明的技术方案还采用了一种乳酸乳球菌表达载体pNZ8149-SPusp45(SEQ IDNO. I)的构建方法，其包括以下步骤I.提取L. lactis NZ3900菌株的基因组DNA，将其作为PCR模板，用于扩增Usp45蛋白分泌信号肽基因SPusp45。2.分别双酶切SPusp45基因和表达载体pNZ8149，回收纯化酶切片段，并用T4DNA连接酶进行定向连接，连接产物用于电穿孔法转化L. lactis NZ3900菌株感受态细胞。3.采用Elliker选择培养基筛选阳性转化菌，培养筛选出的转化菌，从菌体中提取质粒，进行PCR、酶切、测序鉴定，鉴定结果为核苷酸序列与预期相符的质粒即为所构建的L. Iactis分泌表达载体，将其命名为pNZ8149-SPusp45。在食品级表达载体pNZ8149-SPusp45的构建方法中，扩增SPusp45基因的引物是根据GenBank数据库中L. lactis NZ3900菌株Usp45蛋白的信号肽基因序列(GenBank:EU382094. I)，应用生物软件Primer 5. 0设计的，上游引物序列为5’ -CATGCCATGGTGATGMAAAAAAGATTAT-3' (SEQ ID NO. 4);下游引物序列为5’-CATGCATGCAGCGTAAACACCTGACAAC-3’ (SEQ ID NO. 5)。在上游引物5’端引入限制性酶切位点Ncol，在下游引物5’端引入SphI限制性酶切位点。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。食品级表达载体pNZ8149-SPusp45包含源自L. lactis NZ3900Usp45蛋白的分泌信号肽基因SPusp45、乳酸乳球菌表达载体pNZ8149的启动子Pnis、复制子r印C和repA、IacF基因、多克隆酶切位点等元件。将外源基因从多克隆位点插入到表达载体pNZ8149-SPusp45中，用于转化L. lactis NZ3900，阳性转化菌经Nisin诱导后，可使分泌信号肽与外源蛋白基因融合表达，分泌信号肽引导外源蛋白分泌至胞外。本发明的技术方案还采用了一种乳酸乳球菌表达载体作为外源蛋白表达载体的应用。所述外源蛋白的编码基因是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)基因。所述外源蛋白是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚基(UreB)。所述幽门螺杆菌尿素酶B亚基的编码基因序列为SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列存在至少95%同源性。同时，本发明的技术方案还采用了一种乳酸乳球菌表达载体在构建能够在乳酸乳球菌中分泌表达幽门螺杆菌尿素酶B亚基(UreB)的载体中的应用，所述能够在乳酸乳球菌中分泌表达幽门螺杆菌尿素酶B亚基(UreB)的载体的核苷酸序列是SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列，被命名为pNZ8149-SPusp45-ureB。本发明的技术方案还采用了一种重组乳酸乳球菌菌株(Lactococcus lactis)NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB，于2012年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No. 6117。更进一步地，本发明的技术方案还采用了一种重组乳酸乳球菌菌株在制备抗幽门螺杆菌疫苗以及制备幽门螺杆菌感染诊断试剂的应用。本发明的技术方案还采用了一种重组乳酸乳球菌菌株作为发酵菌株在食品加工方面的应用。重组表达载体pNZ8149_SPusp45_ureB 与菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB的构建方法包括以下步骤I)提取H. pylori MEL-HP27菌株基因组DNA，作为PCR模板，用于扩增幽门螺杆菌ureB基因；2)分别双酶切ureB基因和表达载体pNZ8149_SPusp45，纯化回收酶切片段，并用T4DNA连接酶进行定向连接，连接产物用于电穿孔法转化L. lactis NZ3900菌株；3)通过Elliker选择培养基筛选和PCR、酶切、测序鉴定，得到阳性转化菌；4)培养经鉴定的阳性转化菌，提取重组质粒，该重组质粒即为构建的分泌表达幽门螺杆菌UreB蛋白的乳酸乳球菌表达载体，将其命名为pNZ8149-SPuSp45-ureB，将含有pNZ8149-SPusp45-ureB 的乳酸乳球菌命名为L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB。在表达载体pNZ8149-SPusp45-ureB的构建方法中，扩增ureB基因的引物是根据GenBank数据库中幽门螺杆菌ureB基因序列(GenBank: AY295085. I)，应用生物软件Primer5. 0 设计的，上游引物序列为 5’ -CATGCATGCATGAAAAAGATTAGCAG-3 (SEQ IDN0. 6)；下游引物序列为:5’-CGCTCTAGACTGACTAGAAAATGCTAAAGAG-3 (SEQ IDN0. 7)。在上游引物 5’端引入SphI酶切位点，在下游引物5’端引入XbaI酶切位点。本发明的实验依据包括，体外培养重组菌株L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB，用乳酸链球菌素(Nisin)诱导外源蛋白表达，并用SDS-PAGE和Western blots方法分析蛋白的表达并鉴定蛋白的免疫活性。结果SDS-PAGE可以检测到L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB分泌表达幽门螺杆菌UreB蛋白。在菌体培养液经离心分离出的上清中，分泌表达的UreB蛋白约占培养液上清蛋白的70% ;通过Westernblots分析检测到表达的UreB蛋白能够与幽门螺杆菌菌体裂解抗原免疫小鼠血清抗体发生免疫反应。本发明通过实验表明，L. lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌株在幽门螺杆菌疫苗和幽门螺杆菌感染诊断试剂制备中有应用价值。本发明具有以下有益效果I)本发明提供了能够在L. Iactis中分泌表达外源蛋白的表达载体pNZ8149-SPusp45,它是通过将具有食品级安全性的L. lactis SPusp45基因与食品级载体PNZ8149连接而成，因而pNZ8149-SPusp45保持了食品级安全性，但克服了 pNZ8149表达载体不能分泌表达外源蛋白的缺陷，这是L. Iactis表达载体研究的一次技术进步。2)本发明应用表达载体pNZ8149_SPusp45构建的表达幽门螺杆菌尿素酶B亚 基(UreB)的载体pNZ8149-SPusp45_ureB,具有在L. Iactis中分泌表达幽门螺杆菌UreB的功能。而幽门螺杆菌UreB是免疫效果最好的幽门螺杆菌疫苗抗原之一。其意义在于pNZ8149-SPusp45-ureB是在具有食品级安全性的载体上构建的分泌表达幽门螺杆菌疫苗抗原的载体，pNZ8149-SPusp45不含抗生素抗性基因，既在安全性方面具有突出的优势，又具有分泌表达幽门螺杆菌疫苗抗原UreB的功能，对幽门螺杆菌疫苗的制备具有非常大的应用价值。3)重组菌株L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB中除幽门螺杆菌疫苗抗原基因ureB外，其余成分均具有食品级安全性。实验证实，该菌株能够分泌表达UreB蛋白，而且表达的UreB蛋白可以与动物免疫血清反应。实验结果表明该重组菌株不仅能够分泌表达具有抗原活性的疫苗抗原，而且其安全性高于现有技术中以幽门螺杆菌UreB为疫苗抗原的同类疫苗株，因而该重组菌株具有独特优势，在幽门螺杆菌疫苗制备中具有应用价值。4)本发明提供的菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB 在诱导培养后，分泌表达的ureB蛋白约占培养液上清总蛋白的70% (图6A)，在现有乳酸乳球菌食品级分泌表达系统中，表达的外源蛋白在培养液中能达到如此高纯度的，尚未见报道。目前，用于幽门螺杆菌感染免疫检测的幽门螺杆菌UreB蛋白抗原一般是采用亲和层析法从大肠杆菌工程菌表达蛋白中纯化制备，其制备过程不仅繁琐，而且由于UreB蛋白分子量较大，在纯化过程存在蛋白降解和变性等突出问题，纯化得到的UreB蛋白的纯度常不理想。将图6A与文献报道的采用亲和层析法制备UreB蛋白实验结果(图6B)进行对比[图6B摘自文献陈帅印，幽门螺杆菌ureB基因在乳球菌中食品级表达及免疫反应性，郑州大学硕士研究生毕业论文，2010，见于中国学术文献网络出版总库]，不难看出，L. lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB培养液上清样品中UreB蛋白的纯度更高。而且,Westernblots 分析结果显不，菌株 NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB 分泌表达的UreB蛋白可与动物免疫血清发生免疫反应，表明菌株NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB的培养液上清可以不经过进一步纯化而作为诊断抗原，用于制备幽门螺杆菌感染免疫检测试剂，例如，将此培养液上清作为抗原用于包被酶联免疫吸附试验(ELISA)反应板(见实施例8)，这样比采用亲和层析技术从菌体蛋白中纯化UreB蛋白的方法简便很多。因此，L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB在幽门螺杆菌感染诊断试剂(包括诊断抗原)制备中具有很大应用价值。
5)L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB 菌株中除疫苗抗原基因 ureB 外，其余成分均具有食品级安全性，最大限度地提高了疫苗抗原UreB表达系统的安全性。可以合理推断，L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌株可以作为发酵菌株，用于食品加工，尤其是乳制品发酵工艺中，生产具有防治幽门螺杆菌感染及相关胃肠疾病作用的保健食品，有望产生可观的社会和经济效益。


图I为乳酸乳球菌表达载体pNZ8149_SPusp45的构 建示意图；图2为SPusp45基因PCR扩增产物电泳图；图中I为DNAMarker (bp) ;2，3，4 :为以NZ3900DNA为模板PCR扩增SPusp45基因的产物；5 :阴性对照；图3为乳酸乳球菌表达载体pNZ8149-SPusp45-ureB的构建示意图；图4为幽门螺杆菌ureB基因PCR扩增产物电泳图；图中I为DNAMarker (bp)；2，3，4为ureB基因的PCR扩增产物；图5为从乳酸乳球菌阳性转化菌中提取的质粒的PCR和酶切鉴定电泳图；图中
I为幽门螺杆菌ureB基因PCR产物，2为用Xba I酶切的pNZ8149，3为用Xba I酶切的 pNZ8149-SPusp45-ureB，4 为用 Xba I +Sph I 双酶切的 pNZ8149-SPusp45_ureB，5 为DNAMarker(bp)；图6A为乳酸乳球菌经诱导后培养液上清和菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳图；图中
I为 Protein marker，4 为 L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB 的培养液上清，5 为L. lactisNZ3900/pNZ8149 的培养液上清，6 为 L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB 菌体总蛋白，7为L. lactis NZ3900/pNZ8149菌体总蛋白，2和3为其它研究的样品；图6B摘自文献[陈帅印，幽门螺杆菌ureB基因在乳球菌中食品级表达及免疫反应性，郑州大学硕士研究生毕业论文，2010，见于中国学术文献网络出版总库]，该图为采用亲和层析法从大肠杆菌工程菌表达蛋白中纯化幽门螺杆菌UreB蛋白的电泳分析图；其在原文献的图题为图3-2工程菌诱导表达产物SDS-PAGE电泳图；图中广8为亲和层析过程中收集UreB蛋白样品,9为未经纯化的工程菌菌体蛋白，10为Protein Marker ；图7为乳酸乳球菌经诱导后培养液上清和菌体总蛋白的Western blots分析图；图中 I 为 Protein marker ；2 为 L. lactis NZ3900/pNZ8149 菌体总蛋白；3，4 为 L. lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB 菌体总蛋白；5 为 L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB 的培养液上清；8 为 L. lactis NZ3900/pNZ8149 培养液上清；6、7 为其它研究样品。
具体实施例方式(一)本发明实验中使用的细菌菌株和质粒Lactococcus lactis NZ3900 菌株(lacF-，pepN: :nisRnisK)购自荷兰 NIZO FoodResearch(Kernhemseweg, Netherlands)。该菌株也可从德国 Mobitec 公司(CiOttinyii-Germany)购得。采用含150ml/L甘油的GM17培养基于_80°C保存该菌种。。Lactococcus lactis 表达载体 pNZ8149 购自荷兰 NIZO Food Research(Kernhemseweg, Netherlands),也可从德国 Mobitec 公司(Gdttingen，Germany)购得。pNZ8149核苷酸序列为SEQ ID NO. 3所示，含启动子Pnis、IacF基因、多克隆酶切位点、复制子repC和repA及终止子等元件，为食品级安全性表达载体。本发明提供的重组乳酸乳球菌菌株(Lactococcus lactis)NZ3900/pNZ8149-SPusp45于2012年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为=CGMCC NO. 6118。采用含150ml/L甘油的GM17培养基于_80°C保存该菌种。本发明提供的重组乳酸乳球菌菌株Lactococcus lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB 保藏号为CGMCC N0.6117。采用含 150ml/L 甘油的 GM17 培养基于-80°C保存该菌种。。幽门螺杆菌菌株Helicobacter pylori MEL-HP27于2005年3月29日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为=CGMCC NO. 1338。采用100g/L的蔗糖溶液与等体积胎牛血清的混合液为菌株保存液，将菌株保存于_80°C冰箱。 ( 二)本发明涉及实验中培养基的配制(I) LB 培养基LB液体培养基称取I. Og胰蛋白胨,0. 5g酵母浸粉,I. Og氯化钠，溶于IOOml蒸馏水中，用10mol/LNa0H调pH值至7. 2，121 °C高压灭菌20min，置4°C保存备用。LB固体培养基称取I. Og胰蛋白胨，0. 5g酵母浸粉，I. Og氯化钠，I. 5g琼脂粉，溶于IOOml蒸懼水中，用10mol/LNa0H调pH值至7. 2,121 °C高压灭菌20min,冷却至约50°C时倾注平板备用。(2)乳酸菌培养基GM17培养基称取4. 25g M17培养基，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7. 2，定容至100ml，121 °C高压灭菌20min，冷却后加入葡萄糖至终浓度为5. 0g/L。GM17培养基平板称取4. 25g GM17培养基，I. 5g琼脂粉，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/LNa0H调pH值至7. 2，定容至100ml，121 °C高压灭菌20min，冷却至约60°C时加入葡萄糖至终浓度为5. 0g/L，混匀后将培养基倒入培养皿中，制成培养基平板。GSGM17培养基称取85. 50g蔗糖，12. 50g甘氨酸，18. 63g M17培养基，溶于400ml蒸馏水中，用lOmol/LNaOH调pH值至7. 2，定容至500ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5. 0g/L。GM17MC 恢复培养基称取 3. 73g M17 培养基，0. 19g MgCl2, 0. 02g CaCl2，溶于 80ml蒸馏水中，用lOmol/LNaOH调pH至7. 2，定容至100ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5. 0g/L。Elliker选择培养基配制方法如下(l)4.0g/L溴甲酚紫储藏液称取0.4g溴甲酚紫，溶于5%的乙醇，用0. IM的NaOH调PH值至8. 0，定容至IOOml。用无菌0. 22 ii m孔径过滤器过滤除菌，4°C保存备用。(2)200g/L乳糖储藏液称20g乳糖,用蒸懼水定容至100ml,用无菌的0. 22 ii m孔径过滤器过滤除菌，分装，_20°C保存备用。(3)取 0. 50g 酵母浸粉(Yeast extract), 2. OOg 胰蛋白胨(Tryptone), 0. 15g无水醋酸钠，0. 40g氯化钠(NaCl), I. 5g琼脂粉(Agar), 0. 05g抗坏血酸,溶于IOOml蒸懼水中，高压灭菌20min。冷却至约60°C时，加入Iml 4. 0g/L溴甲酚紫储藏液(终浓度为40mg/L)和2. 5ml的200g/L乳糖储藏液(终浓度5. Og/L)，倾倒平板，4°C保存备用，三天内使用。(3)幽门螺杆菌培养基布氏血平板培养基称取大豆蛋白胨l.OOg，胰蛋白胨1.0(^，酵母浸出粉0. IOg,氯化钠0. 50g,亚硫酸钠0. Olg,琼脂粉I. 50g,加入蒸懼水100ml,调pH至7. 2,121 °C高压灭菌20min,冷却至60°C左右时,加入羊血8ml,胎牛血清5ml,并加入下列4种抗生素10mgL万古霉素0. 5ml,2mg/L两性霉素0. 5ml，2500U/L多粘菌素0. lml,5mg/L磺胺增效剂(TMP)
0.2ml。混匀后倾倒入经高压灭菌的玻璃培养皿中。(三)本发明涉及实验中使用的试剂M17培养基(青岛海博生物技术有限公司产品)、氯霉素(美国Amresco公司)、T4DNA连接酶和限制性内切酶Nco I、Sph I和Xba I (美国Fermentas公司)、凝胶回收试剂盒(杭州爱思进(AxyGen)生物科技有限公司)、高纯度质粒提取试剂盒和DNA Marker III (北京康为世纪生物科技有限公司)、PCR反应试剂盒和RNA酶(RNase A)(北京天根生化科技有限公司)、其他常用试剂均为国产分析纯级试剂。未作特别说明的实验材料和方法属于公知技术。在本发明所属技术领域，常用工具书包括《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克和D. W拉塞尔著，第三版，科学出版社，2002)
坐寸o实施例1L. Iactis表达载体pNZ8149_SPusp45的构建L. Iactis 表达载体 pNZ8149_SPusp45 的构建参见图 I。I.用 PCR 方法扩增 L. Iactis 基因 SPusp45I. 1L. lactis NZ3900 基因组 DNA 的提取(I)从_80°C冰箱取出L. lactis NZ3900菌种保存管，从中取100 U I菌液接种至5ml GM17液体培养基中，于30°C、5%C02静止培养12h，取I. 5ml 3ml菌液，5000r/min离心5min,收集菌体。(2)用 500 ii I TE 缓冲液(IOmM Tris-Cl，ImM EDTA, pH8. 0)洗涤菌体一次。(3)用50iU TE缓冲液重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为10mg/ml，37 °C水浴60mino(4)加入蛋白酶K至终浓度为50 u g/ml，混匀后加入100g/L的SDS至终浓度为10gL，37t^KS2h。(5)补充300 U I TE缓冲液，分别用等体积的酚氯仿(苯酚与氯仿等体积混合液)、氯仿异戍醇(氯仿与异戍醇体积比为24 I)抽提蛋白，转速为10000r/min,离心15min。(6)加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3. OM乙酸钠，轻柔颠倒离心管数次至出现絮状沉淀。(7) 10000r/min离心5min收集DNA，将沉淀用70%乙醇洗涤。(8)自然干燥后，用50 ill TE缓冲液溶解DNA。(9)加RNA酶(RNaseA)至终浓度为50 u g/ml，在37°C水浴30min。将基因组DNA置于-20°C贮存。I. 2PCR引物设计与合成根据GenBank数据库中乳酸菌SPusp45基因序列(GenBank:EU382094. I)，利用生物软件Primer 5. 0 设计PCR 引物，上游引物序列为 5，-CATGCCATGGTGATGAAAAAAAAGATTAT-3’(SEQ ID NO. 4);下游引物序列为5，-CATGCATGCAGCGTMACACCTGACMC-3，(SEQ ID NO. 5)。在上游引物5’端引入Nco I酶切位点，在下游引物5’端引入Sph I酶切位点。预期扩增产物长度为95bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。I. 3SPusp45 基因的 PCR 扩增(I)参照PCR反应试剂盒(北京天根生化科技有限公司)产品说明，配制50 Ul反应体系8iimol/L 的上游引物 liil，8iimol/L 的下游引物 liil，2XTaq PCR Master Mix25 u I, NZ3900菌株基因组DNA模板2 yl，加去离子水至50 yl。(2) PCR 循环条件预变性 94°C 5min，94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30S，30个循环，最后72°C延伸5min。(3) PCR产物分析取3 ill PCR反应产物，于20gL琼脂糖凝胶中电泳，电压为5V/cm,用DNA Marker III做分子量标记，电压5V/cm,电泳20min后,用凝胶图像扫描仪进行分析。2. SPusp45基因与表达载体pNZ8149的双酶切与回收取PCR扩增得到SPusp45基因，用限制性内切酶Sph I和Nco I进行双酶切，并用Sph I和Nco I双酶切质粒pNZ8149。酶切体系为Sph I I. 5 u I, Nco I I. 5u I,IOXBuffer 5 y I、质粒 pNZ8149 或 SPusp45 基因 25 y I、去离子水 17 y I。37°C酶切 12h。用凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物科技有限公司)对酶切片段进行纯化回收，操作步骤如下(I)取50 ill双酶切产物在2% (W/V)的琼脂糖凝胶中电泳20min，依据DNA Marker条带的位置，在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，用滤纸将凝胶表面液体吸干，然后装入I. 5ml的洁净的I. 5ml EP管中，称凝胶重量，根据重量估算凝胶体积(IOOmg的凝胶按IOOiil体积估算)。(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE_A，混合均匀后于75°C水浴，间断混合，直到凝胶完全溶化。(3)加入0. 5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B,混合均勻(在处理SPusp45基因双酶切产物时，需再加I个凝胶体积的异丙醇)。(4)将步骤(3)的混合液转移至DNA制备管中，12000r/min离心Imin,弃滤液。(5)将制备管置回2ml离心管,加500 u I Buffer ffl, 12000r/min离心30s,弃滤液。(6)将制备管置回2ml离心管，加700 u I Buffer W2, 12000r/min离心30s,弃滤液。以同样的方法再用700 ii I Buffer W2洗漆一次，12000r/min离心lmin。(7)将制备管置回2ml离心管中，12000r/min离心lmin。(8)将制备管置于洁净的I. 5ml离心管中，在制备膜中央加30iil去离子水，室温静置lmin。12000r/min离心2min洗脱DNA，将得到的DNA置_20°C保存。3. SPusp45基因与表达载体pNZ8149的定向连接将回收的SPusp45基因与L. Iactis表达载体pNZ8149用T4DNA连接酶于16°C进行连接反应16h。连接反应体系T4DNA连接酶lyl、pNZ814912u I, SPusp452u I, 10XBuffer2u I、去离子水 3 y I。16°C连接反应 16h。4. L. lactis NZ3900菌株感受态细胞的制备
(I)从培养NZ3900的GM17培养基平板上挑取单菌落接种于5ml GSGM17培养基中，放入CO2培养箱，30°C、5%C02静止过夜培养(本说明书中“过夜”所指时长为12tTl4h)；(2)将过夜培养的5ml菌液加入50ml GSGM17培养基中，30°C、5%C02静置培养12h 14h ；(3)将培养的50ml菌液加入400ml GSGM17培养基中，30°C、5%C02静置培养至OD6tltl约为0. 3 ；(4)将菌液于4°C、4000r/min离心20min,收集菌体；(5)用冰冷的400ml的洗液I (0. 5M鹿糖，100ml/L甘油)洗漆一次,4000r/min、4°C离心20min，收集菌液；(6)用冰冷的200ml洗液II (0. 5M蔗糖，100ml/L甘油，50mM EDTA)重悬菌体，冰上静置15min ;4000r/min、4°C离心20min,收集菌体；(7)再用冰冷的洗液1(0. 5M蔗糖，100ml/L甘油)100ml重悬菌体，4000r/min、4°C离心20min，收集菌体；(8)用4ml冰冷的洗液I (0. 5M蔗糖，100ml/L甘油)悬浮菌体，分装入事先冰浴的
0.5mlEP管中，每管40 iil，储存于-80°C。5. L. lactis NZ3900菌株的电转化与筛选(I)从-80°C取出保存的NZ3900菌株感受态细胞，立即放入冰上。(2)制备好的连接产物中加入2. 5倍体积的无水乙醇，1/10体积的2. 5mol/L乙酸钠，混勻后于_20°C放置lh, 12000r/min离心5min,弃上清;用Iml 75%乙醇沉淀一次，12000r/min离心5min,弃上清,室温干燥20min,用去离子水溶解沉淀；(3)取纯化连接产物I U I加入感受态细菌，混匀，静止于冰上5min。(4)将混合液加到冰冷的Imm电击转化杯中，用食指轻轻敲击电击杯保证混合液位于电击杯的底部；(5)擦干电击杯外的水，放入电击仪；(6)设置电击参数为25iiF、200Q、1500V，进行电击；(7)电击完毕后，快速加入Iml冰冷的GM17MC恢复培养基，混匀，将混合物转到 1.5ml的EP管中冰浴5 IOmin ;于30°C、5%C02培养箱静置恢复培养2h ；(8)取100 U I恢复培养的菌液接种到Elliker选择培养基上，于30°C、5%C02培养箱静置培养12h，黄色菌落为阳性转化菌。6.阳性转化菌的鉴定培养筛选的阳性转化菌，采用高纯度质粒提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，参照产品说明提取质粒，操作步骤如下(I)从上述Elliker选择培养基上挑取黄色单菌落接种于5ml液体GM17培养基，放入CO2培养箱，30°C、5%C02静止培养12h。(3)取3ml过夜培养的菌液,加入离心管中，13000r/min离心lmin,弃上清。(4)向菌体沉淀中加入250 u I Buffer Pl和100 U I浓度为100mg/ml的溶菌酶，
使用涡旋振荡器悬浮细菌沉淀。(5)向离心管中加入250 U I Buffer P2，上下颠倒混匀4 6次，使菌体充分裂解，持续时间不应超过5min,以免质粒受损。
(6)向离心管中加入350 ill Buff erN3，上下颠倒混匀4 6次，此时出现白色絮状沉淀。(7) 13000r/min 离心 IOmin,吸取上清，加入到已装入 Collection Tube 的 SpinColumnCM 中。(8) 13000r/min(r/min)离心 30 60s,倒掉 Collection Tube 中的废液，将 SpinColumn CM 放回 Collection Tube 中。(9)向 Spin Column CM 加入 5OOii I Buffer PB, 13000r/min 离心 30 60s,倒掉Collection Tube 中的废液，将 SpinColumn CM 重新放回 Collection Tube 中。
(10)向 Spin Column CM 中加入 700 u I Buffer PW (含无水乙醇)，13000r/min 离心 30 60s,倒掉 Collection Tube 中的废液,将 Spin Column CM 重新放回收 CollectionTube 中。(11)向 Spin Column CM 中加入 500iil Buffer PW, 13000r/min 离心 lmin,倒掉Collection Tube 中的废液,将 Spin Column CM 重新放回收 Collection Tube 中。(12) 13000r/min离心lmin,倒掉废液。将Spin Column CM置于室温数分钟，以彻底晾干吸附膜上残余的Buffer PW。(13)将Spin Column CM置于一个新的离心管中，向吸附膜的中心位置滴加50 y IBufferEB,室温放置I 2min, 13000r/min离心lmin,将质粒收集到离心管中，-20°C|C存。对质粒进行PCR和测序鉴定。PCR鉴定是采用提取的质粒为模板，PCR扩增SPusp45基因，反应体系和反应条件如前述。由北京华大基因公司对提取的质粒SPusp45基因进行测序。结果如下I.分泌信号肽基因SPusp45的PCR扩增结果PCR扩增SPusp45基因产物在20g/L琼脂糖凝胶中的电泳结果显示，PCR扩增产物的长度与预期的长度(95bp)符合，证实PCR扩增SPusp45基因成功(图2)。2.阳性转化菌的筛选结果用pNZ8149与SPusp45连接产物电转化NZ3900感受态细胞后，加入800 U I冰预冷的GM17MC恢复培养基，恢复培养3h，取100 ill菌液接种于Elliker选择培养基上，培养两天后，可见Elliker培养基上有黄色的阳性转化菌落。3.阳性转化菌的鉴定挑取Elliker培养基上的黄色菌落接种到GM17液体培养基，培养12h后，提取质粒，PCR鉴定结果为扩增产物长度与预期片段长度(95bp)相符；将质粒交由北京华大基因公司对质粒中SPusp45基因进行测序，结果得到SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列。将测序得到的基因序列与Genbank上公布的SPusp45基因序列(GenBank:EU382094. I)进行BLAST比对，结果显示二者相同。结果证明从该阳性转化菌中提取的重组质粒即为所要构建的表达载体，将该表达载体命名为pNZ8149-SPusp45，将含有该表达载体的重组L. Iactis菌株命名为Lactococcus lactis NZ3900/pNZ8149_SPusp45 (其保藏号为CGMCC NO. 6118)。采用含150ml/L甘油的GM17培养基于_80°C保存该菌株。实施例2L. Iactis 表达载体 pNZ8149_SPusp45_ureB 的构建L. Iactis 表达载体 pNZ8149_SPusp45_ureB 的构建参见图 3。
I.幽门螺杆菌的培养从-80°C冰箱取出幽门螺杆菌H. pylori MEL-HP27菌种，取500 U I菌液加入布氏血平板培养基上，用玻璃棒将菌液涂匀，待菌液被培养基吸收后，于37°C，微需氧条件下(5%02、10%C02、85% N2)培养 3 4 天。2.幽门螺杆菌基因组DNA的提取(I)把培养3 4d的幽门螺杆菌菌体刮入装有500 U I去离子水的I. 5ml离心管中，加入 100 u I 100g/L SDS 溶液，煮沸 5min。(2)加入RNA酶至终浓度为50 ii g/ml，37°C lh，加蛋白酶K至终浓度为50 y g/ml，42°C 作用 Ih。(3)分别用等体积酚、酚氯仿(苯酚与氯仿等体积混合物)、氯仿各抽提一次。 (4)加入2倍体积无水乙醇和1/10体积2. 5mol/L乙酸钠后，于_80°C沉淀lh。15000r/min 离心 15min。(5)用75%无水乙醇洗涤沉淀两次，加入IOOu I去离子水，_80°C贮存备用。3.幽门螺杆菌ureB基因的PCR扩增。3. IPCR引物设计与合成根据GenBank数据库中幽门螺杆菌ureB基因序列(GenBank:AY295085. I)，利用生物软件Primer 5. 0设计PCR引物，上游引物序列为5’_CATGCATGCATGAAAAAGATTAGCAG-3’ (SEQ ID NO. 6);下游引物序列为5，-CGCTCTAGACTGACTAGAAAATGCTAAAGAG-3’ (SEQ ID NO. 7)。在上游引物5’端引入Sph I酶切位点，在下游引物5，端引入Xba I酶切位点。由上海捷瑞生物工程有限公司合成。3.2PCR 反应体系:8iimol/L 的上游引物 liil，8iimol/L 的下游引物 liil，2XTaqPCRMaster Mix 25 u 1，幽门螺杆菌基因组DNA模板2 U I，加去离子水至50 yl。3. 3PCR 循环条件如下95°C 预变性 5min，94°C 变性 lmin，退火 55°C lmin，72°C 延伸3min,30个循环，最后72°C延伸IOmin03. 4PCR产物分析直接取5ul PCR反应产物，用10g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，电压5V/cm, 20min,用凝胶图像分析仪分析凝胶图像。3.幽门螺杆菌ureB基因和载体pNZ8149_SPusp45的酶切与回收取PCR扩增得到的ureB基因，用限制性内切酶Sph I和Xba I进行双酶切，并用 Sph I 和 Xba I 双酶切质粒 pNZ8149。酶切体系为Xba I I. 5 u I, SphI I I. 5u I,IOXBuffer 5 y I、pNZ8149_SPusp45 或 ureB 基因 25 y I、去离子水 17 y I。于 37°C酶切反应 12h。用凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物科技有限公司)对酶切片段进行纯化回收，操作步骤参见实施例I。5.幽门螺杆菌ureB基因与载体pNZ8149-SPusp45的连接将回收的ureB基因与载体pNZ8149-SPusp45用T4DNA连接酶于16°C连接反应 16h。连接反应体系T4DNA 连接酶 I yl、pNZ8149_SPusp4512 yl、ureB 基因 2yl、IOXBuffer 2^1、去离子水3111。于16°C连接反应16h。然后在连接反应管中加入50 yl无水乙醇，2iil乙酸钠溶液(0. 3mol/L，pH5. 8)，混匀后于_20°C放置lh，12000r/min离心5min,弃上清；用lml75%乙醇沉淀一次，12000r/min离心5min,弃上清,室温干燥20min,用去离子水溶解沉淀，用于转化乳酸乳球菌。
6. L. lactis NZ3900菌株的电转化与筛选(I)从_80°C取出贮存的L. lactis NZ3900感受态细胞，放在冰上。(2)取上述经纯化的连接产物Iiil加入到40iUL. lactis NZ3900感受态细胞中，混勻，于冰上放置5min。(3)将菌液加至用冰预冷的Imm电击转化杯中，用食指轻轻敲击电击杯保证菌液位于电击杯的底部；(4)擦干电击杯外的水，放入电击仪；(5)设置电击参数为25iiF、200Q、1500V，进行电击；(6)电击完毕后，快速加入Iml冰冷的GM17MC恢复培养基，混匀，将菌液转到I. 5mlEP管中，冰浴5 IOmin ;于30°C，5%C02培养箱中恢复培养2h ； (7)取100 ill恢复培养的菌液，接种到Elliker选择培养基上，于30°C、5%C02培养箱中培养12 14h，黄色菌落为阳性转化菌。7.阳性转化菌的鉴定(I)从Elliker选择固体培养基上挑取黄色单菌落，接种于5ml GMl7液体培养基中，于30°C、5%C02培养箱中培养12h。用质粒提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取重组质粒。(2)阳性转化菌的PCR鉴定PCR鉴定是以提取的质粒为模板，PCR扩增ureB基因，反应体系和反应条件参照前述。产物用10g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析。(3)阳性转化菌的酶切鉴定取PCR鉴定为阳性的质粒10 U I分别进行XbaI单酶切和Xbal+SphI双酶切，37°C酶切反应4h，65°C灭活lOmin。用10g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析。(4)阳性转化菌的测序鉴定由北京华大基因公司对提取的质粒中SPusp45基因和ureB基因进行测序。结果如下I. ureB的基因PCR扩增结果用提取的幽门螺杆菌染色体DNA为模板，PCR扩增ureB基因，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析的结果显示，扩增基因片段长度与预期长度(1728bp)相符(图4)。2.阳性转化菌的筛选用ureB基因与pNZ8149_SPusp45连接产物转化L. lactis NZ3900感受态细胞后，在Elliker选择培养基上，于30°C、5%C02培养箱静置培养12 14h，可见黄色的阳性转化菌落。3.阳性转化菌的鉴定挑取黄色菌落接种至GM17液体培养基中，培养12h，用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒，以提取的质粒为模板，用前述ureB基因扩增引物进行PCR鉴定，结果显示，PCR扩增产物的长度与预期相符。将PCR鉴定为阳性的质粒分别用XbaI单酶切和Xbal+SphI双酶切，单酶切产生的片段长度为4. 4kb，双酶切片段长度分别为2. 7kb和I. 7kb，均与预期长度一致(图5)。4.阳性转化菌的测序鉴定将酶切鉴定为阳性的质粒送交北京华大基因公司，对质粒中SPusp45和ureB基因进行测序，SPusp45的测序结果为SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列，ureB基因测序结果为SEQ IDNO. 8所示核苷酸序列。将得到序列与Genbank上公布的SPusp45基因序列(GenBank:EU382094. I)和幽门螺杆菌 HP-MEL27ureB 基因序列(GenBank: AY295085. I)进行BLAST比对，基因序列相同。结果表明，从阳性重组菌中提取的质粒即为所要构建的分泌表达幽门螺杆菌ureB基因的L. Iactis表达载体，将该表达载体命名为pNZ8149-SPusp45-ureB (SEQ ID NO. 9)，将含有该表达载体的重组L. lactis菌株命名为L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB (其保藏号为=CGMCC NO. 6117)。采用含 150ml/L甘油的GM17培养基于_80°C保存该菌株。实施例3重组菌株L. lactis NZ3900/pNZ8149的制备重组菌株L. lactis NZ3900/pNZ8149的制备既可采用菌株L. lactis NZ3900销售商荷兰NIZO Food Research或德国Mobitec公司提供的技术方法,也可采用如下方法I.制备 L. lactis NZ3900 感受态细胞 方法同实施例I。2. L. lactis NZ3900菌株感受态细胞的电转化取I ill购置的表达载体PNZ8149与40 ii 1L. lactis NZ3900感受态细胞混合，电转化L. Iactis和阳性转化菌的筛选方法与实施例I相同。3. L. Iactis阳性转化菌的鉴定3. I从筛选阳性转化菌的GM17培养板上挑取黄色单菌落接种至5ml GM17培养基中，放入CO2培养箱，30°C、5%C02静置培养12h。取3ml菌液，参照实施例I的方法从乳酸乳球菌中提取质粒。3. 2分别用NcoI和Sph I单酶切提取的质粒。NcoI酶切体系为NcoI IuU10XBuffer2iil、质粒 lOiil、去离子水 9iil。37°C 酶切 4h。Sph I 酶切体系为SphI
II u IUOXBuffer 2 yl、质粒10 yl、去离子水9 yl。37°C酶切12h。酶切产物用10g/L的琼脂糖凝胶进行电泳分析。结果显示从筛选的阳性转化菌中提取的质粒经酶切得到片段长度与预期片段长度2548bp符合，证明该阳性转化菌即为构建正确的重组L. Iactis菌株，将其命名为L. lactisNZ3900/pNZ8149。采用含150ml/L甘油的GM17培养基，于_80°C保存该菌株。实施例4幽门螺杆菌菌体裂解抗原免疫小鼠血清的制备本发明中检测乳酸乳球菌表达UreB蛋白免疫活性所采用的幽门螺杆菌菌体裂解抗原免疫小鼠血清，可参照文献方法制备[张小娟，幽门螺杆菌UreB和HspA蛋白在乳酸乳球菌中的表达及其免疫反应性研究，郑州大学博士研究生论文，2008，中国学术文献网络出版总库]，也可按以下方法制备。I.幽门螺杆菌菌体裂解抗原(lysate antigens)的制备采用布氏血平板培养基，于37 °C，微需氧条件下(5%02、10%C02、85%N2)，培养H. pylori MEL-HP27菌株3 4d。将培养的幽门螺杆菌刮入生理盐水中，混匀后离心去上清。用 6ml PBS (IOmM Na2HPO4, 2. 7mM KCl, 137mM NaCl,2mM KH2PO4, pH 7. 4)重悬细菌，进行超声破碎，条件为300w,超声IOs,间歇10s，共30次。菌液于40C，8000g离心30min,取上清测定总蛋白浓度，调整蛋白浓度为0. g/iil。为制备初次免疫抗原，取2ml幽门螺杆菌菌体裂解抗原与2ml弗氏完全佐剂混匀后，进行超声乳化，条件为200w，10s,间歇lmin，共4次。为制备加强免疫抗原，取2ml浓度为0. 5 ii g/ ill的幽门螺杆菌菌体裂解抗原与2ml弗氏不完全佐剂混合，进行超声乳化，条件为200w，10s,间歇lmin，共4次。2.免疫小鼠选择8周龄的Balb/c小鼠10只，第I周，每只小鼠股部和腹腔注射初次免疫抗原200 u I (含蛋白约50 u g)，分别在第2周、第3周、第4周以同样的方式注射加强免疫抗原(200 iil/次/只，含蛋白约50 ii g)各I次。3.免疫血清采集最后I次免疫后I周，摘眼球取血液，凝血后分离血清，-20°C保存备用。应用常规Western blots分析，检测到制备的免疫血清与幽门螺杆菌菌体裂解抗 原发生明显免疫反应，证明免疫血清制备成功。也可参照工具书《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克和D. W拉塞尔著，第三版，科学出版社，2002)用ELISA方法对血清抗体滴度进行测定。实施例5 菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB 的诱导表达I. UreB蛋白的诱导表达(I)在培养菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB 的 GM17 培养基平板上用接种环刮取单菌落接种于IOml GMl7液体培养基，于30°C、5%C02培养箱，静置培养12h。(2)取2ml菌液加入到50ml GMl7液体培养基，于30°C、5%C02培养箱，静置培养至菌液OD6tltl为0. 3 0. 4时，加入诱导剂Nisin至终浓度为25ng/ml，诱导培养5h。(3)同时用L. lactisNZ3900/pNZ8149作为诱导表达实验的阴性对照。2.菌体总蛋白和菌液上清蛋白样品的收集2. I菌体总蛋白样品的收集(I)诱导5h后,取IOml菌液于4°C、8000r/min离心5min,弃上清，留取菌体沉淀；(2)加 columu buffer (200mM NaCl,20mM Tris-HCl, ImM EDTA, IOmM ^ -巯基乙醇，pH 7. 4) 3ml悬浮菌体,8000r/min、4°C离心5min,弃上清；(3)加 columu buffer 200 ii I 重悬菌体,加入 22 ii I 溶菌酶(终浓度为 10mg/ml),37°C 水浴 Ih。(4)8000r/min、4°C离心5min,取IOOy I上清,加入等体积的2X电泳上样缓冲液(100 mM P -巯基乙醇、IOOmM pH 6. 8Tris_HCl、4%SDS、20% 甘油、0. 2% 溴酚蓝)，煮沸 3min，于-20°C贮存备用；另取IOOii I上清样品用于蛋白含量的测定。2. 2培养液上清蛋白样品的收集(I)取 36ml 过夜培养的菌液，10000r/min,离心 20min ；(2)取上清，用0. 22 y m的过滤膜过滤上清，过滤后加4ml分析纯三氯醋酸，混匀，放入4°C冰箱使蛋白沉淀12h ；(3) 10000r/min离心30min,弃上清，加入8ml丙酮重悬沉淀，10000r/min离心20min,弃上清,通风橱内风干样品。(4)用 360 ii I PBS (IOmM Na2HPO4, 2. 7mM KCl, 137mM NaCl,2mM KH2PO4, pH 7.4)于4°C溶解沉淀3h。lOOOOr/min离心lOmin，取上清分装入离心管中，200 U I加入等体积的2X上样缓冲液，煮沸3min，于-20°C贮存备用。3.重组菌株诱导产物的SDS-PAGE分析
参照工具书[J.萨姆布鲁克和D.W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002]，操作步骤如下采用12%的分离胶和5%的浓缩胶。每孔按20 U g 50 U g上样。电泳开始时电压为80V，待溴酚蓝泳至分离胶，将电压改为120V，电泳2h。电泳结束后，切除浓缩胶部分，将分离胶用考马斯亮蓝染色，室温下染色4h。染色后，先用蒸馏水将胶洗涤2次，并用脱色液脱色，待蛋白条带清晰后，用凝胶图像分析仪进行分析。结果SDS-PAGE 电泳分析结果显示，L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB 在诱导后，培养液上清样品中出现分子量约为61kD (千道尔顿)的蛋白条带，与ureB基因编码蛋白分子量一致，为ureB基因诱导表达产物，对照组菌株L. lactis NZ3900/pNZ8149培养液上清样品电泳图谱在61kD位置无蛋白条带(图6A)。结果表明，L. lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌株能有效分泌表达UreB蛋白，表达的蛋白约占培养液上清总蛋 白的70%。实施例6L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB 表达蛋白的免疫鉴定参照工具书[J.萨姆布鲁克和D. W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002]，操作步骤如下I. SDS-PAGE 电泳用实施例 5 所述方法制备 L. lactis NZ3900/pNZ8149、L. lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB培养液上清和菌体蛋白，并进行SDS-PAGE分析。2.转膜=SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶切成所需大小，把硝酸纤维素膜(北京索莱宝科技有限公司)和厚滤纸剪成与凝胶相同大小，将硝酸纤维素膜在甲醇中浸润15s。在Bio-Rad电转仪中依次叠放厚滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜和厚滤纸。18V,冰浴转膜2h。3.封闭转膜后，用 PBS (IOmM Na2HPO4, 2. 7mM KCl, 137mM NaCl,2mM KH2PO4, pH7. 4)漂洗硝酸纤维素膜一次，然后将硝酸纤维素膜置于封闭液(含20g/L脱脂奶粉的PBS)中，室温缓慢摇动封闭2h，封闭后，用PBS洗涤3次，每次漂洗IOmin ；4. 一抗反应免疫血清用封闭液1:100稀释，硝酸纤维素膜置于稀释后的免疫血清中，37°C 孵育 lh。用 PBS 洗 3 次，每次漂洗 lOmin。再用 TBS(0. 15mM NaCl，0. IM Tris-HCl,pH 7. 5)漂洗3次，每次持续IOmin ；5. 二抗反应在硝酸纤维素膜上加入用含20g/L脱脂奶粉的TBS稀释过的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37°C lh，用TBS溶液漂洗3次，每次IOmin ；6.显色将硝酸纤维素膜放入平皿中，用DBA显色试剂盒(北京康为世纪科技有限公司)进行显色，参照产品说明书，步骤为取Iml试剂B入到I. 5ml离心管中，再向离心管中加入50 u I试剂A，混匀后，将混合液滴加在硝酸纤维素膜上，显色f 5min，显色后把膜放入到去离子水中浸泡，终止反应。结果如下Western blots 分析结果显不在经诱导的 L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌株培养液上清样品中，在预期位置出现了阳性反应带(UreB分子量为 61. 4KD),在 L. lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB 菌体蛋白样品电泳图谱的相应位置也出现了阳性反应带。对照菌株L. lactis NZ3900/pNZ8149菌体蛋白和培养液上清样品的电泳图谱中均无相应条带(图7)。结果表明，菌株L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB在诱导剂作用下能分泌表达幽门螺杆菌UreB蛋白，且表达的UreB蛋白具有免疫活性。实施例7L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB 在制备口服疫苗中的应用培养菌株L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB，用 Nisin 诱导疫苗抗原 UreB分泌表达，将菌液或菌体培养液上清制成适合人类口服的剂型，用作口服疫苗。人类口服这种疫苗后，可产生抗幽门螺杆菌感染的免疫力和防治幽门螺杆菌相关疾病的有益效果。实施例8L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB在制备免疫诊断试剂的应用培养菌株L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB ;用诱导剂诱导 UreB 基因表达；离心分离出培养液上清，该上清含有重组表达的UreB抗原，而且该蛋白抗原约占培养液上清蛋白的70%，可直接用作幽门螺杆菌感染免疫检测的诊断抗原。其应用方法举例用通过实施例5方法分离制备的L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB培养 液上清包被普通96孔ELISA平板，每孔加入200 U I培养液上清，室温放置2h，使培养液上清抗原包被反应孔；用PBS液洗涤反应孔3次；在ELISA反应孔中加入待检测人类血清，37 °C温育2h ;用PBS液洗涤反应孔3次；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，37°C 温育 2h ;用 TBS 缓冲液(0. 15mM NaCl, 0. IM Tris-HCl，pH 7. 5)洗涤反应孔3次；加辣根过氧化物酶的底物(如DAB)显色；用酶标仪测定各反应孔OD值，以菌株L. lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45培养液上清为对照，根据对照孔的OD值设立阳性反应判定标准，可对各实验孔免疫反应强度进行半定量或定性。应用菌株L. lactisNZ3900/pNZ8149-SPuSp45-ureB培养液上清制备幽门螺杆菌感染诊断抗原比现有技术中通过亲和层析方法从菌体蛋白中纯化UreB抗原要简便很多，因此，该菌株在诊断抗原制备面很有应用前景。实施例9菌株L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB在食品加工中的应用菌株L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB 在食品(包括饮品)加工中的应用方法包括取适量L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌株，加入到食品加工材料中，使混合物在适宜于该菌株生长的条件下，例如30°C，5%C02环境，发生发酵反应，并在适当时机加入Nisin，诱导菌株表达疫苗抗原UreB。制成的食品中可以含有存活的或灭活的该菌株。该菌株除表达的疫苗抗原外，其余菌体及产物成分均具有食品级安全性。L. lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45_ureB作为发酵菌株，用于乳制品或其它食品加工工艺中，使产品含有幽门螺杆菌疫苗抗原UreB，产品被人类食用或饮用后，具有预防幽门螺杆菌感染及其相关疾病的有益作用。该重组菌在食品加工中的应用可为我国食品工业尤其是乳制品工业发展产生促进作用，有望产生巨大社会和经济效益。序列表SEQUENCE LISTING〈110〉郑州大学〈120〉一种乳酸乳球菌表达载体及其制备方法与应用〈130〉说明书<160>9<170>PatentIn version 3. 5<210>1
<211>2622<212>DNA〈213〉人工序列<221>pNZ8149-SPusp45〈222〉⑴(2622)〈400〉Ictagtcttat aactatactg acaatagaaa cattaacaaa tctaaaacag tcttaattct60atcttgagaa agtattggta ataatattat tgtcgataac gcgagcataa taaacggctc120tgattaaatt ctgaagtttg ttagatacaa tgatttcgtt cgaaggaact acaaaataaa180ttataaggag gcactcacca tggtgatgaa aaaaaagatt atctcagcta ttttaatgtc240tacagtgata ctttctgctg cagccccgtt gtcaggtgtt tacgctgcat gcggtaccac300tagttctaga gagctcaagc tttctttgaa ccaaaattag aaaaccaagg cttgaaacgt360tcaattgaaa tggcaattaa acaaattaca gcacgtgttg ctttgattga tagccaaaaa420 gcagcagttg ataaagcaat tactgatatt gctgaaaaat tgtaatttat aaataaaaat480caccttttag aggtggtttt tttatttata aattattcgt ttgatttcgc tttcgataga540acaatcaaat cgtttctgag acgttttagc gtttatttcg tttagttatc ggcataatcg600ttaaaacagg cgttatcgta gcgtaaaagc ccttgagcgt agcgtgcttt gcagcgaaga660tgttgtctgt tagattatga aagccgatga ctgaatgaaa taataagcgc agcgtccttc720tatttcggtt ggaggaggct caagggagtt tgagggaatg aaattccctc atgggtttga780ttttaaaaat tgcttgcaat tttgccgagc ggtagcgctg gaaaattttt gaaaaaaatt840tggaatttgg aaaaaaatgg ggggaaagga agcgaatttt gcttccgtac tacgaccccc900cattaagtgc cgagtgccaa tttttgtgcc aaaaacgctc tatcccaact ggctcaaggg960tttgaggggt ttttcaatcg ccaacgaatc gccaacgttt tcgccaacgt tttttataaa1020tctatattta agtagcttta ttgttgtttt tatgattaca aagtgataca ctaattttat1080aaaattattt gattggagtt ttttaaatgg tgatttcaga atcgaaaaaa agagttatga1140tttctctgac aaaagagcaa gataaaaaat taacagatat ggcgaaacaa aaaggttttt1200caaaatctgc ggttgcggcg ttagctatag aagaatatgc aagaaaggaa tcagaacaaa1260aaaaataagc gaaagctcgc gtttttagaa ggatacgagt tttcgctact tgtttttgat1320aaggtaatat atcatggcta ttaaaaatac taaagctaga aattttggat ttttattata1380tcctgactca attcctaatg attggaaaga aaaattagag agtttgggcg tatctatggc1440tgtcagtcct ttacacgata tggacgaaaa aaaagataaa gatacatgga atagtagtga1500tgttatacga aatggaaagc actataaaaa accacactat cacgttatat atattgcacg1560aaatcctgta acaatagaaa gcgttaggaa caagattaag cgaaaattgg ggaatagttc1620agttgctcat gttgagatac ttgattatat caaaggttca tatgaatatt tgactcatga1680atcaaaggac gctattgcta agaataaaca tatatacgac aaaaaagata ttttgaacat1740taatgatttt gatattgacc gctatataac acttgatgaa agccaaaaaa gagaattgaa1800gaatttactt ttagatatag tggatgacta taatttggta aatacaaaag atttaatggc1860ttttattcgc cttaggggag cggagtttgg aattttaaat acgaatgatg taaaagatat1920tgtttcaaca aactctagcg cctttagatt atggtttgag ggcaattatc agtgtggata1980
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<211>28<212>DNA〈213〉人工序列〈221〉引物〈222〉(I) (28)<400>5catgcatgca gcgtaaacac ctgacaac28<210>6<211>26<212>DNA〈213〉人工序列〈221〉引物〈222〉(I) (26)<400>6catgcatgca tgaaaaagat tagcag26<210>7<211>31<212>DNA〈213〉人工序列〈221〉引物〈222〉(I)(31)<400>7cgctctagac tgactagaaa atgctaaaga g31
<210>8<211>1710<212>DNA〈213〉人工序列<221>ureB〈222〉(I) (1710)<400>8atgaaaaaga ttagcagaaa agaatatgtt tctatgtatg gccctactac aggcgataaa 60gtgagattgg gcgatacaga cttgatcgct gaagtagaac atgactacac catttatggc 120gaagagctta aattcggtgg cggtaaaact ttgagagaag gcatgagcca atccaacaac 180cctagcaaag aagaactgga tttaatcatc actaacgctt taatcgtgga ttacaccggt 240atttataaag cggatattgg tattaaagat ggcaaaatcg ctggcattgg caaaggcggc 300aacaaagaca tgcaagatgg cgttaaaaac aatcttagcg tgggtcctgc tactgaagcc 360ttagctggtg aaggtttgat cgtaactgct ggtggtattg acacacacat ccacttcatc 420tccccccaac aaatccctac agcttttgca agcggtgtaa caacgatgat tggtggcgga 480actggccctg ctgatggcac taacgcaacc actatcactc caggcagaag aaatttaaaa 540
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权利要求
1.一种乳酸乳球菌表达载体，其特征在于包含有如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的乳酸乳球菌表达载体，其特征在于其含有乳酸乳球菌Usp45蛋白的信号肽基因SPusp45，SPusp45基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示，通过在所述表达载体中插入外源基因，并将载体转入乳酸乳球菌，可使SPusp45基因与外源基因在乳酸乳球菌中融合表达，进而实现外源蛋白在乳酸乳球菌中的分泌表达。
3.—种如权利要求I所述乳酸乳球菌表达载体的构建方法，其特征在于其包括以下步骤 (1)以L.Iactis NZ3900菌株基因组DNA为模板，PCR扩增得到SPusp45基因； (2)SPusp45基因与表达载体pNZ8149经双酶切和回收后，进行定向连接； (3)将连接产物用于电转化L.Iactis NZ3900菌株感受态细胞； (4)采用Elliker选择培养基筛选阳性转化菌； (5)培养阳性转化菌，提取质粒，进行酶切和测序鉴定，得到乳酸乳球菌表达载体，并将其命名为 pNZ8149-SPusp45。
4.一种如权利要求I所述乳酸乳球菌表达载体作为外源蛋白表达载体的应用。
5.根据权利要求4所述乳酸乳球菌表达载体作为外源蛋白表达载体的应用，其特征在于 所述外源蛋白的编码基因是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)基因。
6.根据权利要求4或5所述乳酸乳球菌表达载体作为外源基因表达载体的应用，其特征在于所述外源蛋白是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚基(UreB)。所述幽门螺杆菌尿素酶B亚基的编码基因序列为SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列或与SEQ IDNO. 8所示的核苷酸序列存在至少95%同源性。
7.—种如权利要求I所述的乳酸乳球菌表达载体在构建能够在乳酸乳球菌中分泌表达幽门螺杆菌尿素酶B亚基(UreB)的载体中的应用，所述能够在乳酸乳球菌中分泌表达幽门螺杆菌尿素酶B亚基(UreB)的载体的核苷酸序列是SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列，被命名为 pNZ8149-SPusp45-ureB。
8.一种重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB,其保藏编号为 CGMCC No. 6117。
9.一种如权利要求8所述的重组乳酸乳球菌在制备抗幽门螺杆菌疫苗以及制备幽门螺杆菌感染诊断试剂的应用。
10.一种如权利要求8所述的重组乳酸乳球菌作为发酵菌株在食品加工方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种可在乳酸乳球菌中分泌表达外源蛋白的食品级表达载体及其构建方法与应用，该载体包含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。其构建方法为用PCR方法扩增乳酸乳球菌Usp45蛋白的信号肽基因SPusp45，将其与食品级表达载体pNZ8149连接，连接产物用于转化大肠杆菌，筛选鉴定阳性转化菌，从中提取重组质粒，得到乳酸乳球菌分泌表达载体pNZ8149-SPusp45。本发明还公开了pNZ8149-SPusp45作为外源蛋白表达载体的应用，包括以pNZ8149-SPusp45为载体构建的分泌表达幽门螺杆菌UreB蛋白的重组乳酸乳球菌及其应用。
文档编号A23C9/12GK102796755SQ20121021828
公开日2012年11月28日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者段广才, 张荣光, 乔丹, 范清堂, 张卫东, 郗园林, 陈帅印 申请人:郑州大学