专利名称：miR-885-5p在制备判断原发性肝癌临床分期的诊断试剂中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及miR-885-5p在制备判断原发性肝癌临床分期的诊断试剂中的用途，具体的说是涉及通过检测原发性肝癌组织中miR-885-5p的表达来判断原发性肝癌临床分期的用途，所述诊断试剂通过原位杂交技术实现对miR-885-5p表达量的的检测。本发明的方法属于临床免疫检测方法，特别是运用原位杂交方法检测miR-885-5p从而判断原发性肝癌临床分期的方法。
背景技术：
原发性肝细胞癌是常见的消化道恶性肿瘤，在世界范围内是排名第五的恶性肿 瘤，世界每年新发现恶性肿瘤病人约635万例，其中肝癌大约占26万例，26万例中42. 5%发生在我国且其发病率仍然呈逐年递增的趋势。肝癌发现一般为晚期，有效的治疗方法为肝切除和肝移植，常规化疗对肝癌治疗效果并不明显，所以肝癌的早期诊断尤为重要，探索有效的肝癌临床诊断标记物和治疗策略具有重要意义。而在诊断肝癌的过程中，除了确诊是否患有肝癌外，因为不同临床发展阶段的肝癌治疗措施和预后并不相同，进一步明确肝癌的临床分期同样非常重要。因此研究和开发合适的能够用于准确判断肝癌临床分期分子标记物具有非常重要的现实意义。microRNAs(miRNAs)是一类含量丰富的非蛋白编码小分子RNA，miRNAs主要是与靶mRNA的3' UTR区域结合，能够抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解，调节多种生物功能。业已表明，肿瘤组织miRNAs表达谱异常与肿瘤的发生发展以及预后密切相关。一些miRNAs，如miR-17-92，可能作为致癌基因；而另一些miRNAs，如miR-15，可作为抑癌基因，它们在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。同时它们在肿瘤干细胞中也发挥着重要的作用。因此miRNAs正成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。miR-885-5p是一种已知的小分子RNA，NCBI基因库查询显示该基因定位于3号染色体的ρ25· 3的10411173-10411246区间(负链)，由Berezikov E等克隆测序发现。现有的报道发现其与神经母细胞瘤的增殖密切相关。我们首次发现miR-885-5p在肝癌和肝炎、肝硬化病人的血清中的表达量远远高于正常对照组，由此推断得出miR-885-5p的表达异常可能和肝病的发病进程有关。
发明内容
本发明通过研究发现miR-885_5p随着肝癌临床分期的增加，表达量明显降低，miR-885-5p可以作为判断肝癌临床分期的诊断标记物，通过生物领域常用的检测方法对肝癌组织中miR-885-5p的含量进行检测能够间接判断肝癌的临床分期。本发明通过采用生物领域常见的原位杂交方法来检测病理组织中的miR-885_5p分子，以此判断肝癌的临床分期。具体来讲就是，通过对病理组织的原位杂交，检测该组织中miR-885-5p分子的表达量，根据原位杂交的结果来判断肝癌的临床分期。其技术内容包括原位杂交和显微镜观察等步骤。石蜡包埋组织切片的原位杂交方法是本领域已知的方法，一般包括脱蜡、乙醇分级水化、蛋白酶消化、分级脱水、杂交、脱水、透明、封片、镜检等步骤。本发明还涉及一种检测miR-885_5p的杂交探针在制备用于判断原发性肝癌临床分期的诊断试剂中的用途，其特征在于，所述探针为丹麦公司exiqon的探针miRCURY LNA Detection probe,具体序列为5’ AGAGGCAGGGTAGTGTAATGGA3’，其中所述的 miR-885_5p 杂交探针是经过地高辛标记的探针。使用所述诊断试剂判断原发性肝癌临床分期的步骤如下( I)脱蜡和水化，具体步骤如下①组织切片置于二甲苯I中浸泡5分钟，②组织切片置于二甲苯II浸泡5分钟， ③组织切片置于二甲苯III浸泡5分钟，④组织切片置于99. 9%乙醇I中上下浸泡10下，⑤组织切片置于99. 9%乙醇II中上下浸泡10下，⑥组织切片置于99. 9%乙醇III浸泡5分钟，⑦组织切片置于96%乙醇I中上下浸泡10下，⑧组织切片置于96%乙醇II中浸泡5分钟，⑨组织切片置于70%乙醇I中上下浸泡10下⑩组织切片置于70%乙醇II中浸泡5分钟，(2)组织切片置于磷酸盐缓冲液PBS中浸泡2-5分钟。(3)孵育蛋白酶K，将100 μ I浓度为15 μ g/ml的蛋白酶K滴加与组织切片表面，37°C孵育10分钟。(4)用磷酸盐缓冲液洗处理过的组织切片2次，每次五分钟。(5)组织切片脱水，具体步骤如下①组织切片置于70%乙醇I中上下浸泡10下，②组织切片置于70%乙醇II中浸泡5分钟，③组织切片置于96%乙醇I中上下浸泡10下，④组织切片置于96%乙醇II中浸泡I分钟，⑤组织切片置于99. 9%乙醇I上下浸泡10下，⑥组织切片置于99. 9%乙醇II浸泡I分钟。(6)探针与miR-885-5p的杂交，将杂交液(50nM) 100 μ I滴加在组织切片中，将其放入湿盒中，55°C孵育I小时。(7) SSC缓冲液洗组织切片，具体步骤如下①组织切片置于55°C的5 X SSC缓冲液浸泡5分钟，②组织切片置于55°C的5 X SSC缓冲液浸泡5分钟，③组织切片置于55°C的I X SSC缓冲液浸泡5分钟，④组织切片置于55°C的I X SSC缓冲液浸泡5分钟，⑤组织切片置于55°C的I X SSC缓冲液浸泡5分钟，⑥组织切片置于55°C的O. 2X SSC缓冲液浸泡5分钟。
(8)封闭液封闭，室温静置15分钟。(9)滴加连有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1:800) 100 μ 1，室温静置I小时。(10) PBST缓冲液洗3次,每次5分钟(所述PBST缓冲液是指Phosphate BufferedSaline with Tween-20,是市场上购买获得产品)(Il)KTBT缓冲液洗2次，每次5分钟(所述KTBT缓冲液是指Tris Buffered Salinewith Tween-20,是市场上购买获得产品)。(12)去离子水洗2次，每次I分钟。(13)核固红IOOml滴加于组织切片上染核，室温静置10分钟。(14)流水洗组织切片10分钟。 (15)脱水、透明，具体步骤如下①组织切片置于70%乙醇中浸泡30秒，②70%乙醇中浸泡I分钟，③组织切片置于96%乙醇中上下浸泡10下④组织切片置于96%乙醇中浸泡I分钟，⑤组织切片置于99. 9%乙醇II上下浸泡10下， ⑥组织切片置于99. 9%乙醇III浸泡I分钟。⑦二甲苯II中浸泡5分钟，⑧二甲苯I浸泡5分钟。(16)树脂封片、镜检。miR-885_5p 的相关基本信息为!Accession No MIMAT0004947,基本序列为5’UCCAUUACACUACCUGCCUCU3’，所采用的杂交探针为丹麦公司exiqon的探针miRCURY LNA Detection probe，具体序列为5’ AGAGGCAGGGTAGTGTAATGGA3’，标记物为地高辛。本发明还涉及一种通过原位杂交技术判断原发性肝癌临床分期的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测miR-885-5p的杂交探针和原位杂交使用的其他常用试剂，所述其他常用试剂是本领域技术人员熟知的常用于试剂盒中的实际，例如脱蜡、预固定处理、固定处理、蛋白酶消化进行透化、分级脱水、杂交等步骤中使用的试剂，例如二甲苯、70%乙醇、96%乙醇、99. 9%乙醇、磷酸盐缓冲液PBS、蛋白酶K、5 X SSC缓冲液、I X SSC缓冲液、0. 2 X SSC、核固红等。当miR-885_5p检测呈强阳性结果时，肝癌样品多为临床分期II期的肝癌组织。当miR-885-5p检测呈弱阳性或阴性结果时，肝癌样品多为临床分期III期的肝癌组织。因此通过对miR-885-5p进行检测，可以区分肝癌样品到底是临床分期为II期的样品，还是临床分期为III期的样本。确定肝癌样品的临床分期可以为患者随后治疗方案的选择和患者预后判断提供一定的帮助，有助于为患者制定个性化的治疗方案，以提供更有针对性的治疗方案。
图I在临床分期II期检测结果中miR-885_5p主要在肿瘤细胞胞浆和胞核均高表达。图2在临床分期III检测结果中miR-885_5p主要在肿瘤细胞胞浆和胞核均低表达。
图3在临床分期III检测结果中miR-885-5p主要在肿瘤细胞胞浆和胞核中几乎不表达。
具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。实施例I样本1、2、3均为肝癌组织切片，采用如下方法对肝癌组织样品中的miR-885_5p进行检测( I)脱蜡和水化，具体步骤如下①组织切片置于二甲苯I中浸泡5分钟，·②组织切片置于二甲苯II浸泡5分钟，③组织切片置于二甲苯III浸泡5分钟，④组织切片置于99. 9%乙醇I中上下浸泡10下，⑤组织切片置于99. 9%乙醇II中上下浸泡10下，⑥组织切片置于99. 9%乙醇III浸泡5分钟，⑦组织切片置于96%乙醇I中上下浸泡10下，⑧组织切片置于96%乙醇II中浸泡5分钟，⑨组织切片置于70%乙醇I中上下浸泡10下⑩组织切片置于70%乙醇II中浸泡5分钟，(2)组织切片置于磷酸盐缓冲液中浸泡2-5分钟。(3)孵育蛋白酶K，将100 μ I浓度为15μ g/ml的蛋白酶K滴加与组织切片表面，37°C孵育10分钟。(4)用磷酸盐缓冲液洗处理过的组织切片2次，每次五分钟。(5)组织切片脱水，具体步骤如下①组织切片置于70%乙醇I中上下浸泡10下，②组织切片置于70%乙醇II中浸泡5分钟，③组织切片置于96%乙醇I中上下浸泡10下，④组织切片置于96%乙醇II中浸泡I分钟，⑤组织切片置于99. 9%乙醇I上下浸泡10下，⑥组织切片置于99. 9%乙醇II浸泡I分钟。(6)探针与miR-885-5p的杂交，将杂交液(50nM) 100 μ I滴加在组织切片中，将其放入湿盒中，55°C孵育I小时。(7) SSC缓冲液洗组织切片，具体步骤如下①组织切片置于55°C的5 X SSC缓冲液浸泡5分钟，②组织切片置于55°C的5 X SSC缓冲液浸泡5分钟，③组织切片置于55°C的I X SSC缓冲液浸泡5分钟，④组织切片置于55°C的I X SSC缓冲液浸泡5分钟，⑤组织切片置于55°C的I X SSC缓冲液浸泡5分钟，⑥组织切片置于55°C的O. 2X SSC缓冲液浸泡5分钟。
(8)封闭液封闭，室温静置15分钟。(9)滴加连有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1:800) 100 μ 1，室温静置I小时。(10) PBST缓冲液洗3次，每次5分钟。(11) KTBT缓冲液洗2次，每次5分钟。(12)去离子水洗2次，每次I分钟。(13)核固红IOOml滴加于组织切片上染核，室温静置10分钟。(14)流水洗组织切片10分钟。(15)脱水、透明，具体步骤如下
①组织切片置于70%乙醇中浸泡30秒，②70%乙醇中浸泡I分钟，③组织切片置于96%乙醇中上下浸泡10下④组织切片置于96%乙醇中浸泡I分钟，⑤组织切片置于99. 9%乙醇II上下浸泡10下，⑥组织切片置于99. 9%乙醇III浸泡I分钟。⑦二甲苯II中浸泡5分钟，⑧二甲苯I浸泡5分钟。(16)树脂封片、镜检。镜检时，切片中有明显蓝紫色颗粒为强阳性(如图I);浅蓝色颗粒为弱阳性(如图2);无明显蓝紫色颗粒的为阴性(如图3)。肝癌样品I的镜检结果如图I所示。由图片结果可见肝癌样品I的组织切片中miR-885-5p的表达程度较高，其中有明显蓝紫色颗粒，即miR-885_5p检测呈强阳性结果，后经病理组织切片检测结果证实该肝癌样品I为临床分期II期的肝癌组织。肝癌样品2的镜检结果如图2和图3所示。由图片可见该组织切片中miR-885-5p的表达程度较低，浅蓝色颗粒的为miR-885-5p检测弱阳性结果，后经病理组织切片检测结果证实该肝癌样品2为临床分期III期的肝癌组织。肝癌样品3的镜检结果如图3所示。由图片可见该组织切片中miR-885_5p的表达程度较低，无明显蓝紫色颗粒，为miR-885-5p检测阴性结果，后经病理组织切片检测结果证实该肝癌样品3为临床分期III期的肝癌组织。实施例2利用包含原位杂交探针的试剂盒对肝癌病例的分析收集肝癌组织样品，根据临床上对肝癌的诊断标准，通过肝癌病理组织切片对肝癌组织样品进行分期，严格筛选得到临床分期分别为I I期和I I I期的233例肝癌病例。病理组织切片判断临床分期分别为I I期和I I I期的具体标准为I期(TlNo Mo)I期肝癌为亚临床期，其中经手术证实肿瘤为单个结节，直径小于5cm者称之为小肝癌；II期(T2No Mo):出现临床症状或体征但无III期表现者；III期(T3 No Mo):有明显恶液质、黄疸、腹水、或远处转移之一者。利用包含序列5，AGAGGCAGGGTAGTGTAATGGA3，的原位杂交探针和其他常用的原位试剂，例如5XSSC缓冲液等的试剂盒，依照实施例I中所述的肝癌组织样品的原位杂交检测方法对这219例肝癌病例样本中的miR-885-5p的含量进行原位杂交检测。检测过程中设置阳性对照、阴性对照和空白对照，其中，采用实施例I中所使用的肝癌样品I作为阳性对照，已知的缺少靶mRNA的组织和细胞作为阴性对照，不添加经标记的核酸探针的检测样品作为空白对照。检测结果表明miR-885_5p在肝癌组织中的表达随着临床分期的升高而降低，具体检测如果如表I所示表lmiR-885-5p在肝癌肿瘤组织中表达情况的分析
权利要求
1.一种检测miR-885-5p的杂交探针在制备用于判断原发性肝癌临床分期的诊断试剂中的用途，其特征在于杂交探针的序列为5’ AGAGGCAGGGTAGTGTAATGGA3’。
2.根据权利要求I所述的用途，其特征在于所述的miR-885-5p杂交探针是经过标记的探针。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的miR-885-5p杂交探针是经过地高辛标记的探针。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于使用所述诊断试剂判断原发性肝癌临床分期的步骤如下 (1)脱蜡和水化，具体步骤如下 ①组织切片置于二甲苯I中浸泡5分钟， ②组织切片置于二甲苯II浸泡5分钟， ③组织切片置于二甲苯III浸泡5分钟， ④组织切片置于99.9%乙醇I中上下浸泡10下， ⑤组织切片置于99.9%乙醇II中上下浸泡10下， ⑥组织切片置于99.9%乙醇III浸泡5分钟， ⑦组织切片置于96%乙醇I中上下浸泡10下， ⑧组织切片置于96%乙醇II中浸泡5分钟， ⑨组织切片置于70%乙醇I中上下浸泡10下 ⑩组织切片置于70%乙醇II中浸泡5分钟， (2)组织切片置于磷酸盐缓冲液中浸泡2-5分钟； (3)孵育蛋白酶K，将100μ I浓度为15 μ g/ml的蛋白酶K滴加与组织切片表面，37°C孵育10分钟； (4)用磷酸盐缓冲液洗处理过的组织切片2次，每次五分钟； (5)组织切片脱水，具体步骤如下 ①组织切片置于70%乙醇I中上下浸泡10下， ②组织切片置于70%乙醇II中浸泡5分钟， ③组织切片置于96%乙醇I中上下浸泡10下， ④组织切片置于96%乙醇II中浸泡I分钟， ⑤组织切片置于99.9%乙醇I上下浸泡10下， ⑥组织切片置于99.9%乙醇II浸泡I分钟； (6)探针与miR-885-5p的杂交，将杂交液(50nM)100 μ I滴加在组织切片中，将其放入湿盒中，55°C孵育I小时； (7)SSC缓冲液洗组织切片，具体步骤如下 ①组织切片置于55°C的5XSSC缓冲液浸泡5分钟 ②组织切片置于55°C的5XSSC缓冲液浸泡5分钟， ③组织切片置于55°C的IX SSC缓冲液浸泡5分钟 ④组织切片置于55°C的IX SSC缓冲液浸泡5分钟， ⑤组织切片置于55°C的IX SSC缓冲液浸泡5分钟， ⑥组织切片置于55°C的O.2X SSC缓冲液浸泡5分钟；(8)封闭液封闭，室温静置15分钟； (9)滴加连有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1:800)100 μ I,室温静置I小时； (10)PBST缓冲液洗3次，每次5分钟。
(11)KTBT缓冲液洗2次，每次5分钟。
(12)去离子水洗2次，每次I分钟。
(13)核固红IOOml滴加于组织切片上染核，室温静置10分钟。
(14)流水洗组织切片10分钟。
(15)脱水、透明，具体步骤如下 ①组织切片置于70%乙醇中浸泡30秒， ②70%乙醇中浸泡I分钟， ③组织切片置于96%乙醇中上下浸泡10下， ④组织切片置于96%乙醇中浸泡I分钟， ⑤组织切片置于99.9%乙醇II上下浸泡10下， ⑥组织切片置于99.9%乙醇III浸泡I分钟； ⑦二甲苯II中浸泡5分钟， ⑧二甲苯I浸泡5分钟； (16)树脂封片、镜检。
5.一种通过原位杂交技术判断原发性肝癌临床分期的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求1-3中任意一项权利要求所述的检测miR-885-5p的杂交探针和原位杂交使用的其他常用试剂。
全文摘要
本发明公开了一种医学诊断用方法，具体的说是一种通过检测原发性肝细胞癌组织中miR-885-5p的表达量来判断肝癌临床分期的方法，该方法是通过原位杂交技术实现的，属于临床免疫诊断方法，特别是运用原位杂交方法检测miR-885-5p从而判断肝癌恶性程度的方法。具体的技术方案是通过探针与小RNA的结合以及抗原抗体反应和呈色反应，显示细胞或组织中的miR-885-5p含量，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应的产物，从而能够在细胞或组织原位确定miR-885-5p的含量。并且以此进一步判断肝癌临床分期的免疫检测方法。本发明所载明的方法对肝癌的临床诊断具有实际意义。
文档编号C12Q1/68GK102888453SQ20121022221
公开日2013年1月23日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者田亚平, 张竹红 申请人:中国人民解放军总医院