一种调控植物光合作用速率的方法
【专利摘要】本发明提供一种调控植物光合作用速率的方法，所述方法是将含有URO基因及启动子序列的表达载体转化植物，提高植物的光合作用。URO基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；启动子的核苷酸序列如序列表中序列2所示；用于构建含有URO基因及启动子序列的表达载体是含有T-DNA序列的双元载体。本发明通过改变转录调控因子基因的表达，使植物的光合作用系统II效率大为提高，从而实现调控植物光合作用速率的目的。
【专利说明】一种调控植物光合作用速率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业作物的遗传育种【技术领域】，具体涉及一种调控植物光合作用速率的方法。
【背景技术】
[0002]提高植物光合速率，是经济作物育种的重要方向之一。例如:将造纸植物的光合速率提高，将加快光能向化学能的转化，加快植物的生长，缩短造纸植物利用的培养周期，提高土地的利用率，降低成本，有利于保护环境。对大部分需要提供大量的同化产物的经济作物而言提高光合效率，缩短培养周期都是重要的育种目标。
[0003]常规育种方法耗时时间长，需要几代的杂交、回交，且新性状的出现依赖已有的品种，可控性较差。转基因育种是国际新兴的育种策略。它的优点是耗时较短，可控性较强。缺点依赖于育种对象的转基因平台的建立，以及可以用于遗传改造的基因序列。目前，可用于提高植物光合作用速率的基因序列报道很少。
[0004]现有技术中，影响植物光合作用的基因序列主要参与光合作用过程中的各种关键酶的表达量调控。这些序列对于调控光合作用均有一定的作用。由于植物体光合作用的途径非常复杂，参与的酶很多，而且往往是多条酶系统同时参与、协同工作，受多重生长发育和环境信号调控。因此，单一改变某一种酶的含量，对于改变植物体内光合作用能力非常有限。某一种酶含量的改变对整个光合作用的影响会受到其它酶和底物含量的限制，即，酶含量的改变对于改变光合作用的影响是比较有限的。
[0005]本发明克服现有技术的以上缺陷，通过在植物细胞中用载体引入URO基因及启动子序列，改变转录调控因子基因的表达，影响植物的整体发育，通过改变光合作用中最重要的光系统II的效率，改变植物对CO2的固定速率。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种调控植物光合作用速率的方法，所述方法是将含有URO基因及启动子序列的表达载体转化植物，使植物的光合速率得到提高；其中，所述URO基因的核苷酸序列如序列表中序列I所示；所述启动子的多核苷酸序列如序列表中的序列2所示；用于构建所述含有URO基因及启动子序列基因的表达载体含有T-DNA序列的双元载体。至目前尚未有文献报道所述URO基因可被用于植物光合作用的人工调控。本发明中，URO基因还可用其它组织特异性启动子启动表达，达到对该基因的表达时空可以进行精确调控的目的，从而更加有效的调控转基因植物光合作用变化。
[0007]其中，所述含有URO基因及部分启动子序列的表达载体为pMon530-UR0 ；所述pMon530-UR0的构建包括如下步骤:以拟南芥的总DNA为模板，并设计引物:上游引物URO-F:5’ctc gagatg aac cac egg gac aaa c,下游引物 UR0-R:5’tta atg atg acg atgacc g ;经PCR循环反应得到扩增产物，得到URO的核酸片段，连接到T-Vector ;将连接产物转化至大肠杆菌，经筛选得到阳性克隆URO-T。URO-T质粒经XhoI和EcoRI酶切后，与经XhoI和EcoR I酶切后的含有35S启动子的双元载体pMon530进行连接，获得含有融合35S启动子和URO的重组载体pMon530-UR0。
[0008]其中，所述PCR循环反应的条件为:94°C 5min ;一次循环94°C 30sec，55°C 45sec,72°C 90sec，30 次循环；72°C IOmin0
[0009]其中，所述植物为草本或木本植物。所述植物为草本植物烟草。
[0010]其中，所述转化方法为农杆菌转化法，基因枪介导转化法，或花粉管通道法。
[0011]本发明调控植物光合作用速率的方法中，所述URO基因是指拟南芥基因At3g23140的核酸序列从翻译起始密码ATG到终止密码TAA，包括终止密码。所述启动子是指花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子的碱基序列。
[0012]其中，所述URO基因的多核苷酸序列如序列表中的序列I所示，该序列I由525个碱基组成。所述35S启动子的多核苷酸序列如序列表中的序列2所示，该序列由546个碱
基组成。
[0013]本发明中，所述T-DNA序列是公开序列，是指农杆菌Ti (tumor inducing)或Ri (root inducing)质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中，已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体。
[0014]本发明中，P35S ::UR0融合基因是指35S启动子与URO基因相接形成的新的基因序列。
[0015]本发明中，pMon530-UR0表达载体是指带有P35S::UR0融合基因的可以转化植物的双元载体。
[0016]本发明中，T-Vector是指就是市场上试剂公司提供的线性3’ -T突出双链DNA片段。T载体利于PCR产物的连接。
[0017]本发明中，URO-T是指含有URO序列的T-Vector。所述URO-T质粒是指含有URO序列的T-Vector质粒。
[0018]本发明中，含有35S启动子的双元载体pMon530是指一个商业化的质粒载体名称为pMon530，该质粒的多克隆位点前面含有一个花椰菜花叶病毒的35S启动子。
[0019]本发明中，所述tbu是指转化有pMon530-UR0的转基因烟草株系，不同株系加不同编号，如 tbu-1, tbu-2 等。
[0020]本发明中，所述启动子可以是任何植物中使用的启动子，包括遍在表达的启动子和组织特异性表达的启动子。
[0021]本发明方法可以提高植物光合速率，是将含有URO基因及启动子的表达载体转化植物，得到叶绿素含量增加，光合速率提高的植物，为培育光合速率提高的植物提供一条新的途径。
[0022]本发明方法可以提高植物光合速率，用于植物的遗传改造，获得光合速率提高的性状。本发明的方法中，提取拟南芥的部分基因片段及一段启动子序列，通过特定启动子与基因的组合，可以驱动调控植物发育基因在特定生长阶段表达，使叶绿素含量增加，植物光系统II的效率升高，提高植物的光合速率。本发明的方法既可以单独转化植物，也可以对启动子区进行修饰，改变该基因的表达位置和时间，以获得目的部位的最适光合速率。利用本发明的方法，可以通过对不同的经济作物进行遗传改造，达到在较短时间内获得光合速率提高的转基因植物。【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为pMon530_UR0融合基因载体构建过程示意图。
[0024]图2 (a)表示野生型烟草植株。
[0025]图2 (b)表示转P35S::UR0融合基因的转基因烟草植株。
[0026]图3为转P35S::UR0融合基因的转基因烟草的RT-PCR鉴定图谱。
[0027]图4为转P35S::UR0融合基因的转基因烟草植株与野生型烟草的叶绿素含量测定结果。
[0028]图5为转P35S:: URO融合基因的转基因烟草植株与野生型烟草的光合速率测定结果。
[0029]图6为转P35S::UR0融合基因的转基因烟草植株与野生型烟草的光系统II效率的测定结果。
【具体实施方式】
[0030]以下实施例是对本发明进一步的详细阐述，而不是对本发明的限制。本发明并不局限于【具体实施方式】的内容，凡基于本发明在权利要求的范围内做出各种变形或修改，均属于本发明的保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0031]本发明调控植物光合作用速率的方法，具体如下:
[0032]培育光合速率升高的转基因烟草。以拟南芥总DNA为模板；设计引物，上游引物URO-F:5’ctc gag atg aac cac egg gac aaa c,下游引物UR0-R:5’tta atg atg acg atgaccg ;进行PCR扩增，PCR反应条件为:94度5min，一个循环；94度30sec，55度45sec，72度90sec, 30循环；72度IOmin进行PCR扩增，然后，电泳、回收、纯化PCR扩增产物，得到URO基因的核酸片段。
[0033]将URO基因核酸片段连接到T-Vector (TAKARA)，并转化至大肠杆菌，经PCR及酶切筛选获得阳性克隆(UR0-T)。经测序，检测结果确定阳性克隆序列正确。
[0034]分别利用XhoI和EcoRI酶进行酶切测序正确的UR0-T质粒，电泳、回收、纯化，与被XhoI和EcoRI酶切后的已含有35S启动子的双元载体pMon530连接。获得含有融合35S启动子和URO基因的重组载体p35S::UR0，测序鉴定正确。之后，将该质粒转化入农杆菌中，并进行鉴定。P35S::UR0融合基因载体pMon530-UR0构建过程，参考图1所示，具体记载在实施例2、3、4、5、6、7中。
[0035]用叶盘法，转化并筛选烟草，获得稳定转化本序列的烟草。提取转化子的RNA，反转录并进行RT-PCR鉴定。图2 (a)为野生型烟草植株，图2 (b)为转P35S::UR0融合基因的转基因烟草植株。图3为转P35S::UR0融合基因的转基因烟草的RT-PCR鉴定图谱，其中wt为野生型对照,其它样品tbu-1, tbu-2, tbu-3为不同株系的转化子。
[0036]待转化子生长3个月后，取同样生长时间和条件的野生型及转化子完全成熟的叶片，测定它们正常生长状况下的光合作用效率。正常生长状况下，转化子的光合效率在光照强度为100-1000勒克斯时均高于野生型烟草；经过T检验，野生型和转化子之间在这一指标上有显著差别。野生型的光合速率在1000勒克斯到400勒克斯光照强度区间较为平缓，基本上在2.SiimolCO2nT2S-1左右，在低于400勒克斯的光照时，光合速率平稳下降，如图5所示；而转化子(tbu-4，tbu-5, tbu-6在1000勒克斯到400勒克斯光照强度区间内表现出持续的高效率的光合作用，基本上都在7.Siim0ICO2nT2s-1左右，最高效率能达到
9.235 V- molC02m 2ms \在低于400勒克斯的光照时，光合效率急剧下降，如图5所不。
[0037]为进一步监测转化子的光系统II的效率，利用Junior-PAM测定了转化子tbu_l与野生型wt烟草叶绿素荧光的OpsII (Fv/Fm)值，该值反应了光系统II的效率。如图6所示，实验结果表明转化子的光系统II的最大光合效率明显高于野生型。
[0038]实施例1，提取拟南芥基因组DNA
[0039]试剂:
[0040]Lysis Buffer =Tris-HCl, pH8.0 (0.2M);尿素(7M);十二烷基肌氨酸钠(2%)；EDTA (0.05M)步骤:
[0041](I)植株的绿叶或花等组织适量，置于1.5ml的离心管中，加200 ill裂解液，用小棒研磨成浆，再用400 ii I裂解液冲洗小棒。
[0042](2)加600 ill的酚-氯仿，剧烈震荡20秒，使蛋白质变性。
[0043](3) 12000rpm离心5分钟后取上清。
[0044](4)加 50 ii I 醋 酸钠，600 U I 异丙醇，混匀，12000rpm 离心 5min。
[0045](5)去上清，沉淀溶于 400 ill TE(Tris-EDTA)中。
[0046](6)再加 40iil 3mol/L NaAC(PH5.2), Iml 无水乙醇，混匀，12000rpm 离心 5min。
[0047](7)去上清，用70%乙醇洗沉淀一次，离心；去清液。
[0048](8)室温干燥，沉淀溶于50 Ul无菌水中，即为提取得到的植物基因组DNA。
[0049]实施例2，PCR方法获得目的基因片段
[0050](I)以实施例1中提取的拟南芥DNA作为模板
[0051]URO基因的多核苷酸序列如序列表中的序列I所示。
[0052](2)引物设计
[0053]根据URO基因及其启动子序列，以及购建克隆方便，设计一对引物，URO-F和UR0-R，其中前者的引物上有一个XhoI的限制性内切酶酶切位点，引物序列为:
[0054]上游引物UR0-F:5’ ctc gag atg aac cac egg gac aaa c,如序列 3 所示。
[0055]下游引物URO-R:5’ tta atg atg acg atg acc g，如序列 4 所示。
[0056](3) PCR扩增目的片段
[0057]PCR试剂:K0D-Plus酶购自于T0Y0B0公司
[0058]PCR反应体系:
[0059]
【权利要求】
1.一种调控植物光合作用速率的方法，其特征在于，所述方法是将含有URO基因及启动子序列的表达载体转化植物，以提高所述植物的光合速率；其中，所述URO基因的多核苷酸序列如序列I所示；所述启动子的多核苷酸序列如序列2所示；用于构建所述含有URO基因及启动子序列基因的表达载体是含有T-DNA的双元载体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有URO基因及启动子序列的表达载体为pMon530-UR0 ;所述pMon530_UR0的构建包括如下步骤:以拟南芥的总DNA为模板，设计引物，上游引物 URO-F:5’ctc gag atg aac cac egg gac aaa c,下游引物 URO-R:5’ttaatg atg acg atg acc g ;经PCR扩增得到URO基因的核酸片段,连接到T-Vector ;将连接产物转化至大肠杆菌，经筛选得到阳性克隆URO-T ；URO-T质粒经XhoI和EcoRI酶切后，与经XhoI和EcoR I酶切后的含有35S启动子的双元载体pMon530上进行连接，获得含有融合35S启动子和URO的重组载体pMon530-UR0。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR循环反应的条件为:94°C5min; —次循环为 94°C 30sec，55°C 45sec，72°C 90sec，30 次循环；72°C IOmin0
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物为草本或木本植物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化方法为农杆菌转化法，基因枪介导转化法，或花粉管通道法。
【文档编号】C12N15/84GK103509818SQ201210224327
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2012年6月29日
【发明者】孙越, 赵惠芳, 刘水 申请人:华东师范大学