专利名称：一株解木聚糖类芽孢杆菌及用其制备木葡聚糖酶的方法
技术领域：
本发明涉及微生物及其制酶技术领域，尤其涉及一株解木聚糖类芽孢杆菌及其制酶方法。
背景技术：
木葡聚糖酶(xyloglucanase, XEG)(编号EC3. 2. I. 151)是水解木葡聚糖主链中β-1，4-糖苷键的一类木葡聚糖特异性内切酶，为一种胞外酶，在GH5，GH12，GH16，GH44和GH74家族中均发现其存在。木葡聚糖酶属于纤维素酶系中的一种小组分酶,对以β_1,4-糖苷键为主链结构的多聚糖，尤其是木葡聚糖具有特异性降解能力，因此可以降解木葡聚糖来生产低聚糖。木葡聚糖酶特别是细菌来源的木葡聚糖酶普遍具有较好的热稳定性，并且在碱性条件下具有较高活性，因此可被广泛应用于各行各业中。①在植物生产中，木葡聚糖酶是调节植物生长的一种重要酶类，可用于定向改造出利于酶解的纤维质原料；②在 生物乙醇行业中，木葡聚糖酶可协同纤维素酶降解纤维质原料，生产生物乙醇；③在食品行 业中，木葡聚糖酶可以使果汁中的浑浊变澄清，改善果汁质量在洗涤剂中，由于木葡聚糖酶在洗涤剂中表现出稳定的酶活力，可用作洗衣粉和洗衣液中的酶添加剂。木葡聚糖酶在其他领域也具有应用潜力，如木聚糖酶有利于药物传递，还可用作新型表面活性剂。利用微生物发酵的方法可生产酶，但是，现有技术所报道的产生木葡聚糖酶的微生物较少，且存在发酵时间长、生产条件不易控制、产物不易分离纯化、产酶水平低等缺点。
发明内容
针对现有技术制备木葡聚糖酶存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一株解木聚糖类芽孢杆菌及用其制备木葡聚糖酶的方法，用所述菌株发酵制备木葡聚糖酶，发酵时
间短，产酶量高。本发明的技术方案如下一株解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus) B20,生物保藏信息为CCTCC No. M 2012149。一种制备木葡聚糖酶的方法，用上述解木聚糖类芽孢杆菌B20，CCTCC No. M2012149作为发酵菌株进行液体发酵，具体步骤如下(I)斜面菌种活化将所述解木聚糖类芽孢杆菌B20，CCTCC No. M2012149划线接种于斜面培养基上，于28 32°C培养24 36h，所述斜面培养基成份按克/升计为蛋白胨8 12，酵母膏4 6，NaCl 8 12，琼脂18 22，其余成分为水，调节pH值至6. 5
7.O ；(2)种子培养将步骤(I)所述斜面培养基上生长的菌种刮下，接种于置于摇床的液体种子培养基中，摇床转速100 300r/min，于28 32°C振荡培养12 18h，所述液体种子培养基成份按克/升计为蛋白胨8 12，酵母膏4 6，NaCl 8 12，木糖2 5，其余成分为水，调节pH值至6. O 7. O ;
(3)液体发酵培养将经过步骤(2)培养所得活化种子液按体积百分比5 10%的接种量，接种于置于摇床的发酵培养基中，摇床转速150 200r/min，于28 32°C振荡培养30 40h，停止发酵，得到发酵液，所述发酵培养基成份按克/升计为蛋白胨8 12，酵母膏20 24，NaCl 5 7，木糖I 3. 5，其余成分为水，调节pH值至6. 5 8. O。 所述解木聚糖类芽孢杆菌B20是通过如下步骤筛选分离得到(I)于2010年3月自我国江苏省无锡市雪浪山下稻田泥中采集土壤样品；(2)按照常规技术手段从南瓜中提取粗木 葡聚糖将南瓜切碎烘干，磨成粉末，于65. 2°C水中浸泡8h，对浸泡液进行离心分离，收集沉淀，将所得沉淀烘干后浸入O. IM NaOH溶液中，浸泡4h后收集提取液，并对该提取液进行离心，收集残渣，再将所得残渣浸入2. 7MNaOH溶液中，浸泡12. 6h，收集提取液，用冰醋酸调节其pH值至5. 0，离心后收集上清液，对该上清液进行透析、浓缩，经过冻干得到粗木葡聚糖；最后用所得粗木葡聚糖配制初筛培养基，所述初筛培养基成分按重量百分数计为0. I %粗木葡聚糖，O. 2% (NH4)2S04,0. 05%MgS04 · 7Η20，0· 1% ΚΗ2Ρ04,0. 05% NaCl, I. 5%琼脂粉，其余成分为水(ρΗ7. O)。(3)富集培养取Ig步骤(I)所采集的土壤样品混悬于50mL生理盐水中，加入玻璃珠打散混匀30min，取ImL打散后的菌悬液加入50mL LB液体培养基中振荡培养14h，并将O. ImL培养后的菌悬液稀释106倍，涂布到步骤(2)所配制的初筛培养基中，于30°C在培养箱中培养过夜，对生长出的菌落进行平板划线分离培养，获得单菌落，于4°C保存，所述LB液体培养基成分按重量百分数计为I %酵母膏，O. 5 %蛋白胨，I % NaCl，其余成分为水。(4)挑取步骤(3)所得单菌落点种于经雷马素亮蓝(Remazol Brilliant Blue)染色的木葡聚糖(AZO-Xyloglucan)质量百分比为O. I %的复筛培养基平板上，于30°C在培养箱中培养过夜，挑取能够产生透明圈的菌株，于4°C保存。所述复筛培养基成分按重量百分数计为0. I % AZ0-xyloglucan,0. 2% (NH4)2S04,0. 05% MgS04 · 7Η20，0· I % ΚΗ2Ρ04,
O.05% NaCl，I. 5%琼脂粉，其余成分为水(ρΗ7. O)。(5)将步骤(4)所保存的菌株接种于液体发酵培养基中，培养40h后测定木葡聚糖酶活力，有酶活力的即为产酶菌株，从上述产酶菌株中筛选出一株木葡聚糖酶产量最高的菌株，命名为解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus) B20。所述液体发酵培养基成分按重量百分数计为0. 1% AZ0_xyloglucan，0. 2% (NH4)2S04,0. 05%MgS04 · 7Η20，0· 1% ΚΗ2Ρ04,0. 05% NaCl, I. 5%琼脂粉，其余成分为水(ρΗ7. O)。本发明所提供的解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus)B20,已于2012年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号CCTCC M 2012149，地址中国，武汉，武汉大学。该菌株以下简称解木聚糖类芽孢杆菌B20CCTCC M 2012149。所述解木聚糖类芽孢杆菌B20CCTCC M 2012194菌株具有下述微生物学特征I.形态特征解木聚糖类芽孢杆菌B20CCTCC M 2012194菌株在LB平板培养基上生长18h，形成的菌落较大，菌落直径5 8_，表面略有褶皱，边缘不整齐，可扩散生长，呈微黄色，不透明，在油镜下观察呈短杆状。2.生理生化特征依据《伯杰氏手册》(R.E.布坎南，N. E.基本斯等编，科学出版社，1984)所述鉴定方法，对解木聚糖类芽孢杆菌B20 CCTCC M 2012194菌株进行生理生化鉴定，其主要生理生化特征见表I。表I
权利要求
1.一株解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus) B20,生物保藏信息为CCTCC No. M 2012149。
2.一种制备木葡聚糖酶的方法，其特征在于用权利要求I所述解木聚糖类芽孢杆菌B20，CCTCC No. M 2012149作为发酵菌株进行液体发酵，制备木葡聚糖酶。
3.根据权利要求2所述制备木葡聚糖酶的方法，其特征在于具体步骤如下 (1)斜面菌种活化将所述解木聚糖类芽孢杆菌B20，CCTCCNo. M2012149划线接种于斜面培养基上，于28 32°C培养24 36h，所述斜面培养基成份按克/升计为蛋白胨8 ·12，酵母膏4 6，NaCl 8 12，琼脂18 22，其余成分为水，调节pH值至6. 5 7. 0 ; (2)种子培养将步骤(I)所述斜面培养基上生长的菌种刮下，接种于置于摇床的液体种子培养基中，摇床转速100 300r/min，于28 32°C振荡培养12 18h，所述液体种子培养基成份按克/升计为蛋白胨8 12，酵母膏4 6，NaCl 8 12，木糖2 5，其余成分为水，调节PH值至6. 0 7. 0 ; (3)液体发酵培养将经过步骤(2)培养所得活化种子液按体积百分比5 10%的接种量，接种于置于摇床的发酵培养基中，摇床转速150 200r/min，于28 32°C振荡培养30 40h，停止发酵，得到发酵液，所述发酵培养基成份按克/升计为蛋白胨8 12，酵母膏20 24，NaCl 5 7，木糖I 3. 5，其余成分为水，调节pH值至6. 5 8. O。
全文摘要
本发明提供一株解木聚糖类芽孢杆菌及用其制备木葡聚糖酶的方法。用解木聚糖类芽孢杆菌B20 CCTCC M 2012194作为发酵菌株进行液体发酵，制备木葡聚糖酶，其制备方法包括在斜面培养基上进行菌种活化，于液体种子培养基中进行种子培养，于发酵培养基中进行液态发酵，最后得到含木葡聚糖酶的发酵液。本发明以解木聚糖类芽孢杆菌B20 CCTCC M 2012194发酵制备木葡聚糖酶，具有发酵时间短、生产条件易于控制、产物易于分离纯化、产酶量高的优点。
文档编号C12N9/42GK102757914SQ20121022560
公开日2012年10月31日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者丁重阳, 张梁, 王宝顺, 石贵阳, 顾正华 申请人:江南大学