专利名称：一种透明质酸菌种复壮新方法
技术领域：
本发明涉及一种菌种复壮的方法，特别涉及一种透明质酸菌种复壮新方法。
背景技术：
在实际生产或实验室中保存的透明质酸菌种经常会发生退化现象，因此，需要不 断进行复壮，以得到性能优良的菌种，常规的复壮方法是利用常规或加富培养基平板，进行 划线分离方法，利用淘汰方法将菌种进行分离，从中选择出性能良好的菌种而得到复壮，但 是这种方法较保守，复壮成功率非常低，而且复壮得到的菌种不够好，容易退化。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种复壮剂原料易得，制作和使用过程简单，提 高了菌种的复壮率和产酸率的透明质酸菌种复壮新方法，解决了上述现有技术中存在的问题。解决上述技术问题的技术方案是一种透明质酸菌种复壮新方法，包括以下步 骤
(1)复壮剂的制备
al、先取土豆切碎成粒度小于5mm的颗粒状，然后将土豆和玉米按重量比为3-4 :1混合 绞碎得到复壮剂原料，再按lg复壮剂原料加入1. 8-2. 2mL水计向复壮剂原料中加入水，得 到混合物；
bl、将步骤al得到的混合物加热至沸腾，然后继续加热使混合物保持沸腾2. 5-3. 5小 时，并蒸发掉混合物体积50%-70%的水，加热过程每间隔20-30分钟对物料进行搅拌防止发 焦；
cl、在无菌操作台上用灭菌的滤布过滤得到浸提液，冷却到常温备用； dl、按羊血与浸提液体积比为2 7-8计把无菌脱纤维绵羊血加入到浸提液中，混合均 匀制得复壮剂，放入2V _6°C的冰箱内保存；
(2)透明质酸菌种复壮
a2、配制透明质酸固体培养基，高温灭菌后冷却至50°C -60°C ； b2、在无菌操作台上将固体培养基体积12-16%的复壮剂加入到固体培养基中，摇匀后 再倒到平板中冷却到室温，得到复壮平板；
c2、把退化的透明质酸菌种斜面或甘油管取出活化25-35分钟，然后用接种环挑出退 化菌种在复壮平板上划线；
d2、把划好线的复壮平板放在培养箱中培养30-40小时，直到菌种在平板上出现透明 质酸单菌落，再用接种环挑出单菌落进行斜面培养，培养好后得到复壮好的菌种放入冰箱 进行保存。步骤a2所述的固体培养基和步骤d2所述的斜面培养采用的培养基的配制如下 先分别称取脑心浸粉37克、酵母粉10克、葡萄糖1克、七水硫酸镁2克，然后一起溶解于1000mL水中，溶解完全后调节液体pH值到7. 2，最后将25克琼脂剪碎放入配制得到。步骤a2所述的高温灭菌是在121 °C高温条件下灭菌30分钟，步骤d2所述的把划 好线的复壮平板放在35V -40°C培养箱中培养，所述的复壮好的菌种放入2V -6°C冰箱进 行保存。本发明之一种透明质酸菌种复壮新方法具有以下有益效果。1.本发明复壮剂原料易得，制作和使用过程简单本发明的复壮剂利用常见的动 物材料(羊血)和植物材料(土豆和玉米)通过简单的粉碎、蒸发浸提、混合等步骤处理后制 得复壮剂，复壮剂与透明质酸固体培养基按一定比例混合后即可用于透明质酸菌种的复 壮。2.提高了菌种的复壮率和产酸率使用该方法使透明质酸菌种的复壮机率提高 10倍以上，即可使每个平板得到的优良菌种个数由原来的1-3个提高到30-40个，而且得到 的菌种性能良好，产酸率提高30%左右。下面，结合实施例对本发明之透明质酸菌种复壮新方法的技术特征作进一步的说 明。
具体实施例方式实施例1 :
一种透明质酸菌种复壮新方法，包括以下步骤
(1)复壮剂的制备
al、先取150克新鲜土豆切碎成粒度小于5mm的颗粒状，然后将土豆和50克新鲜土豆 一起放入豆浆机中绞碎，再加入到装有400毫升水的1800mL烧杯中混合均匀；
bl、将上述混合物加热，加热到水小开沸腾，保持物料上下翻滚，烧杯上加盖玻璃片以 防水过分蒸发，加热保持沸腾的时间为3小时左右，每间隔20分钟对物料进行搅拌防止发 焦，将水蒸发掉50%-70% (体积比)，得到300-400mL混合液；
cl、在无菌操作台上以无菌操作方式用灭菌的滤布过滤出120mL浸提液，冷却到常温 备用;
dl、在无菌操作台上把30mL无菌脱纤维绵羊血加入到上述120mL浸提液中，混合摇匀 而制得150mL复壮剂，放入2V _6 °C的冰箱内保存。(2)透明质酸菌种复壮
a2、配制透明质酸固体培养200ml，121 °C高温灭菌30分钟，冷却到60°C ； b2、在无菌操作台上按15%(体积比)比例把30ml复壮剂加入到上述60°C透明质酸固 体培养基中，摇匀后再分别倒到10个平板中冷却到室温，制成10个透明质酸菌种用的复壮 平板；
c2、把退化的透明质酸菌种斜面或甘油管取出活化30分钟，然后用接种环挑出退化菌 种在复壮平板上划线；
d2、把划好线的复壮平板放在35°C _40°C培养箱中培养30-40小时，直到菌种在平板上 出现肥厚且粘性高的单菌落，再用接种环挑出单菌落进行斜面培养，培养好后得到复壮好 的菌种可放入2V _6°C冰箱进行保存，最后得到性能优良的透明质酸菌种。实施例2:一种透明质酸菌种复壮新方法，包括以下步骤
(O复壮剂的制备
al、先取225克新鲜土豆切碎成细小块(小于5mm)状物，然后将土豆和75克新鲜土豆一起放入豆浆机中绞碎，再加入到装有600毫升水的ISOOmL烧杯中混合均匀；
bl、将上述混合物加热，加热到水小开沸腾，保持物料上下翻滚，烧杯上加盖玻璃片以防水过分蒸发，加热保持沸腾的时间为2. 5-3. 5小时，每间隔20分钟对物料进行搅拌防止发焦，将水蒸发掉50%-70% (体积比)，得到450-600mL混合液；
Cl、在无菌操作台上以无菌操作方式用灭菌的滤布过滤出160mL浸提液，冷却到常温备用;
dl、在无菌操作台上把40mL无菌脱纤维绵羊血加入到上述160mL浸提液中，混合摇匀而制得200mL复壮剂，放入2 V _6°C的冰箱内保存。(2)透明质酸菌种复壮与实施例I相同。本发明各实施例所述的无菌脱纤维绵羊血是由绵羊以无菌方式采血，玻璃珠摇床脱纤而成的羊血，可以从市场上购买。步骤a2所述的固体培养基和步骤d2所述的斜面培养采用的培养基的配制如下先分别称取脑心浸粉37克、酵母粉10克、葡萄糖I克、七水硫酸镁2克，然后一起溶解于装有IOOOml水的三角瓶中，溶解完全后调节液体pH值到7. 2，最后将25克琼脂剪碎放入配制得到。本发明各实施例所述的新鲜的土豆是指出土 10天内的土豆，新鲜的玉米是指10天内米摘的玉米。本发明各实施例所述的透明质酸菌种可以是兽疫链球菌、马链球菌、类马链球菌 或多杀性巴氏杆菌等，实验证明，上述这些透明质酸菌种使用本发明复壮后，可使每个平板得到的优良菌种个数由原来的1-3个提高到30-40个，而且产酸率提高30%左右。
权利要求
1.一种透明质酸菌种复壮新方法，其特征在于包括以下步骤 (O复壮剂的制备 al、先取土豆切碎成粒度小于5mm的颗粒状，然后将土豆和玉米按重量比为3-4 :1混合绞碎得到复壮剂原料，再按Ig复壮剂原料加入I. 8-2. 2mL水计向复壮剂原料中加入水，得到混合物； bl、将步骤al得到的混合物加热至沸腾，然后继续加热使混合物保持沸腾2. 5-3. 5小时，并蒸发掉混合物体积50%-70%的水，加热过程每间隔20-30分钟对物料进行搅拌防止发焦； Cl、在无菌操作台上用灭菌的滤布过滤得到浸提液，冷却到常温备用；dl、按羊血与浸提液体积比为2 :7-8计把无菌脱纤维绵羊血加入到浸提液中，混合均匀制得复壮剂，放入2V _6°C的冰箱内保存； (2)透明质酸菌种复壮 a2、配制透明质酸固体培养基，高温灭菌后冷却至50°C -60°C ；b2、在无菌操作台上将固体培养基体积12-16%的复壮剂加入到固体培养基中，摇匀后再倒到平板中冷却到室温，得到复壮平板； c2、把退化的透明质酸菌种斜面或甘油管取出活化25-35分钟，然后用接种环挑出退化菌种在复壮平板上划线； d2、把划好线的复壮平板放在培养箱中培养30-40小时，直到菌种在平板上出现透明质酸单菌落，再用接种环挑出单菌落进行斜面培养，培养好后得到复壮好的菌种放入冰箱进行保存。
2.根据权利要求I所述的一种透明质酸菌种复壮新方法，其特征在于步骤a2所述的固体培养基和步骤d2所述的斜面培养采用的培养基配制如下先分别称取脑心浸粉37克、酵母粉10克、葡萄糖I克、七水硫酸镁2克，然后一起溶解于IOOOmL水中，溶解完全后调节液体PH值到7. 2，最后将25克琼脂剪碎放入配制得到。
3.根据权利要求I或2所述的一种透明质酸菌种复壮新方法，其特征在于步骤a2所述的高温灭菌是在121 °C高温条件下灭菌30分钟，步骤d2所述的把划好线的复壮平板放在350C _40°C培养箱中培养，所述的复壮好的菌种放入2V _6°C冰箱进行保存。
全文摘要
本发明涉及一种透明质酸菌种复壮新方法，该方法利用常见的动物材料(羊血)和植物材料(土豆和玉米)通过特殊的处理方法得到复壮剂，具体步骤先将土豆和玉米混合绞碎，再加入水；加热至沸腾2.5-3.5小时，并蒸发掉混合物体积50%-70%的水；然后过滤得到浸提液备用；最后把无菌脱纤维绵羊血加入到浸提液中混合均匀制得复壮剂。复状剂按一定比例加入到透明质酸菌种选择固体培养基中，制成复壮平板，然后把退化的菌种用接种环接到该平板中进行划线分离，培养后获得性能良好的透明质酸菌种。本发明复壮剂原料易得，制作和使用过程简单，使用该方法使菌种的复壮机率提高10倍以上，而且得到的菌种性能良好，产酸率提高30%左右。
文档编号C12N1/00GK102703322SQ201210233180
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者刘树新, 欧韦福, 黄云兵 申请人:柳州市柳化集团大力透明质酸有限公司