专利名称：一种快速检测kras基因突变的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测KRAS基因突变的方法。
背景技术：
基因突变是指基因组DNA分子在结构功能上发生碱基组成或排列顺序的改变，主要包括碱基的替代和片段的插入缺失，是导致基因型疾病的重要原因之一。基因突变分析在生物医学研究中，尤其是在基因型疾病诊断及病理研究中有着非常重要的作用。KRAS基因编码的蛋白参与由表皮生长因子受体(EGFR)介导的细胞信号转导通路，影响细胞的增殖、生长和转移；正常的KRAS基因编码的蛋白在接受上游信号活化后被激活，并将在信号
传递给下游细胞因子后恢复非激活状态；而突变的KRAS基因所编码的蛋白无需上游信号活化便始终处于激活状态，导致细胞的非正常增殖和生长，引起恶性肿瘤。抗EGFR类肿瘤药物通过特异性阻滞EGFR与受体结合，阻断细胞转导通路，从而达到抑制癌细胞增殖的目的；多项研究发现，接受抗EGFR药物治疗的结直肠癌患者中，KRAS基因野生型的病人较KRAS基因突变型病人更能从治疗中受益具有更高的药物客观反应率和较长的生存时间。因此，能够准确检测KRAS突变状态对指导结直肠癌患者临床用药有重要意义。传统检测KRAS基因突变的方法多种多样，其中最为经典是双脱氧测序技术，此外还包括等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、连接酶检测反应(LDR)、多聚酶链限制性长度多态性分析(PCR-RFLP)和TaqMan技术。虽然这些方法能够检测突变是否存在，但大多数方法不能确定突变的类型并且只能检测到突变的一部分；同时大多数方法需要琼脂糖凝胶电泳等PCR后处理检测才能分析结果，准确度和灵敏度受到限制。近年来，等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR,ARMS)、高分辨溶解曲线(HRM)、变性高效液相色谱分析(dHPLC)和焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)等方法改善了检测的灵敏度和特异性，但仍存在假阳性现象严重和操作繁琐等缺点。分子信标探针(Molecular Beacon)是一种可以自发形成茎环结构的双标记寡核昔酸探针，其5’末端标记有突光基团，3’末端标记有洋灭基团；当颈环结构形成后，突光基团和淬灭基团空间距离靠近，发生荧光共振能量转移(FRET)，荧光基团被外界光源激发后发出的光子被淬灭基团吸收，此时探针不能被激发出荧光；若体系中存在与探针序列相匹配的模板，当分子信标探针与模板杂交后，其发夹结构被打开，使得荧光基团与淬灭基团空间距离增大，此时突光基团被激发出的突光未被淬灭，可以检测突光信号；同时由于突光强度与体系中模板的量呈正比，故分子信标探针可以用于实时定量PCR反应。当分子信标与模板链杂交后，若继续升高温度可导致探针与模板再次分离，从而使得荧光强度随温度升高而降低。将荧光强度对温度变化时间求导数便得到熔解曲线，熔解曲线的峰值为荧光信号降低速率最大时对应的温度，即为模板与探针结合强度(Tm值)。由于序列的差别，探针与野生型模板和突变型模板的结合强度有差别，表现在熔解曲线(熔解峰)的不同。传统的熔解曲线法灵敏度较低，使得检测结果不准确。
发明内容
为了克服传统探针熔解曲线法灵敏度低，检测不精确的缺点，本发明提出一种快速检测KRAS基因突变的方法，不仅节省了耗材，同时具有高灵敏度，高特异性的特点，检测
结果更可靠。为实现以上发明目的，本发明提供如下基本技术方案。
一种快速检测KRAS基因突变的方法，包括以下步骤(I)分子信标探针和模板扩增引物的设计及合成上游引物(25nt):5’ -GATAGTGTATTAACCTTATGTGTGA-3’延伸阻滞引物(38nt):
权利要求
1.一种快速检测KRAS基因突变的方法，包括以下步骤 (1)分子信标探针和模板扩增引物的设计及合成 上游引物(25nt):·5’ -GATAGTGTATTAACCTTATGTGTGA-3’ 延伸阻滞引物(38nt):
2.根据权利要求I所述的快速检测KRAS基因突变的方法，其特征在于 以单管反应体系25iil计，反应管中加入上游引物500nM，延伸阻滞引物50nM，UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0. 2U，5’ 一3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM Taq DNAPolymerase) 0. 5U，dNTPs (脱氧核糖核苷三磷酸)200 u M，dUTP (脱氧尿苷三磷酸)400 u M，分子信标探针 250nM，10 X PCRBuffer (TIANNIUM Taq PCR Buffer) 2. 5 y 1，ddH20补足体积·25 u I。
3.根据权利要求2所述的快速检测KRAS基因突变的方法，其特征在于 PCR 反应参数设置如下:50°C，2 5min ;95°C，12 15min ;95°C，2 5sec ;56°C，(Tlsec ；·65 °C,O^lsec ;55 65个循环；熔解95°C，l 5min ;50°C— 72 °C每秒收集荧光15 20次，0.02 0. 05 °C梯度升温。
全文摘要
本发明提出一种快速检测KRAS基因突变的方法，以克服传统探针熔解曲线法灵敏度低，检测不精确的缺点。该快速检测KRAS基因突变的方法，包括以下步骤(1)分子信标探针和模板扩增引物的设计及合成；(2)提取被测样本的KRAS基因组DNA；(3)配制反应体系；(4)PCR反应；PCR反应完成后进行熔解曲线分析，通过熔解峰的Tm值判断出被测样本中是否发生了KRAS突变。本发明将分子信标探针和延伸阻滞引物结合起来，并利用无5’→3’外切酶活性聚合酶进行体外快速检测KRAS突变，不仅节省了耗材，同时具有高灵敏度，高特异性的特点，使检测结果更可靠。
文档编号C12Q1/68GK102796817SQ201210233750
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者陈超, 刘金辉, 戴鹏高, 王浩, 王刚 申请人:陕西北美基因股份有限公司