专利名称：反硝化菌的分离方法
技术领域：
本发明涉及细菌分离领域，尤其涉及一种反硝化菌的分离方法。
背景技术：
反硝化菌是一类把硝酸盐氮转化为氮气的兼性厌氧微生物。这类微生物一般只有在厌氧的条件下，才能诱导出反硝化作用所需的硝酸盐还原酶A和亚硝酸还原酶，以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体进行脱氮。由于微生物所需环境的不同，因此在污水处理的整个脱氮过程，即硝化过程和反硝化过程，系统的抗冲击能力比较差，高浓度的氨氮、硝态氮会抑制硝化菌的生长，高浓度的溶解氧和碳源不足会抑制反硝化菌的生长，从而影响脱氮总体效果。但目前没有有效获得反硝化菌的方法，以将得到的反硝化菌用于污水处理进行硝化及反硝化过程脱氮。
发明内容
本发明实施方式提供一种反硝化菌的分离方法，可以解决目前没有有效获得反硝化菌的方法，不能将得到的反硝化菌用于污水处理进行硝化及反硝化过程脱氮的问题。为解决上述问题本发明提供的技术方案如下本发明实施方式提供一种反硝化菌的分离方法，包括米集原料米集颗粒污泥溶液为原料，将所述颗粒污泥溶液制成囷悬液；分离筛选培养对制成的所述菌悬液进行分离筛选培养，培养后得到培养物；培养物检测对分离筛选培养后得到的培养物进行检测，检测合格的培养物中的菌株即为反硝化菌。由上述提供的技术方案可以看出，本发明实施方式提供的方法，通过微生物学的方法，分离筛选得到反硝化菌的纯培养物，通过出培养物的分离筛选，能够在实验室里快速得到反硝化菌，投加入反硝化反应池中，快速增加反硝化效果，增加系统的抗冲击能力。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。下面对本发明实施例作进一步地详细描述。实施例I本实施例提供一种反硝化菌的分离方法，该方法具体如下采集原料采集上流式厌氧污泥床(upflow anaerobic sludge blanket,UASB)或生活污水处理厂缺氧池内的颗粒污泥溶液为原料，用漩涡振荡器将颗粒污泥溶液中的颗粒污泥破碎后制成菌悬液；
分离筛选培养对制成的所述菌悬液进行分离筛选培养，培养后得到培养物；具体是将所述菌悬液转入分离筛选培养基中，采用焦性没食子酸法，在25 35°C温度下厌氧培养5 7天，培养后得到培养物。上 述采用的焦性没食子酸法具体是在干燥无菌的培养皿皿盖(也可以平板玻璃板)上，铺设一层灭菌脱脂棉或纱布，将焦性没食子酸设置在所述脱脂棉或纱布上；向焦性没食子酸上滴加氢氧化钠溶液后，将所述培养皿皿盖覆盖于装有已接种所述菌悬液的分离筛选培养基的培养皿上，使设有焦性没食子酸和氢氧化钠溶液的所述脱脂棉或纱布全部罩住培养皿的皿口，以溶化的石蜡或凡士林液密封培养皿的皿口与皿盖的接触处，使所述菌悬液在密闭的由焦性没食子酸与氢氧化钠溶液反应形成的厌氧环境下在分离筛选培养基中进行培养。上述分离筛选培养中，所用的分离筛选培养基由下述各原料按重量份组成蒸馏水1000份、柠檬酸钠4 6份、硝酸钾I. 7 2. 3份、磷酸氢二钾O. 8 I. 2份、磷酸二氢钾O. 8 I. 2份、七水硫酸镁O. I O. 2份和微量元素溶液I 3份；分离筛选培养基的pH值为7. O 7. 2。上述分离筛选培养基中的微量元素溶液由下述各原料按重量份组成蒸馏水1000份、乙二胺四乙酸(EDTA) 40 50份、氯化钙5 6份、五水硫酸铜I 2份、四水氯化锰4. 5 6份、七水硫酸亚铁4 6份和六水氯化钴I 2份；微量元素溶液的pH值为7. O 7. 2。培养物检测对分离筛选培养后得到的培养物进行检测，检测合格的培养物中的菌株即为反硝化菌。上述培养物检测，具体包括以下几种方式(I)采用厌氧滚管培养法，将分离筛选培养培养后得到的培养物接入检测培养基，在30 40°C温度下厌氧培养3 5天，对检测培养基中硝酸盐的质量浓度进行检测；若检测培养基中硝酸盐的质量浓度不高于30%，则确认检测培养物合格，合格的培养物中的菌株即为反硝化菌；或者(2)先测得检测培养基总氮含量的第一含量值；采用厌氧滚管培养法，将分离筛选培养后得到的培养物接入检测培养基，在30 40°C温度下厌氧培养3 5天，对检测培养基中总氮含量进行检测得到第二含量值；若测得的检测培养基中总氮的第二含量值相比第一含量值降低的量大于等于10% (如测得检测培养基总氮含量的第一含量值为50，而测得检测培养基总氮含量的第二含量值为6，则(50(第一含量值)一第二含量值6(第二含量值))/50(第一含量值)X 100%=88%，则可以确定检测培养基中总氮含量相比之前的总氮含量降低了 88%)，则确认检测培养物合格，合格的培养物中的菌株即为反硝化菌。上述培养物检测中所用的检测培养基由下述原料按重量份组成蒸馏水1000份、柠檬酸钠4 6份、硝酸钾I. 7 2. 3份、磷酸氢二钾O. 8 I. 2份、磷酸二氢钾O. 8 I. 2份、七水硫酸镁O. I O. 2份和微量元素溶液I 3份。进一步的，可以在检测培养基中加入质量浓度为1%的溴百里酚蓝溶液I重量份作为指示剂，可在厌氧滚管培养法培养接入分离筛选培养物的检测培养基后，当检测培养基变成蓝色来直观判断，培养物是否合格。质量浓度为1%的溴百里酚蓝可由100重量份的乙醇和I重量份的溴百里酚蓝配成。上述培养物检测中采用的厌氧滚管培养法具体为将装有检测培养基的试管放置于40 60°C的恒温水浴中，用无菌注射器吸取分离筛选的培养物转入所述试管内的检测培养基中，而后将所述试管放于滚管机上进行滚动，使带有所述培养物的检测培养基在所述试管内壁凝固形成薄层，处理后将所述试管置于30 40 °C的恒温培养箱中进行培养。本发明实施例中通过，在分离筛选中，采用焦性没食子酸法，通过焦性没食子酸和氢氧化钠溶液反应，可提高良好的厌氧环境，使装有已接种菌悬液的分离筛选培养基在密封的厌氧化环境中进行培养，方便得到含有反硝化菌株的培养物。该方法操作简单，成本低，对反硝化菌分离效果好。 实施例2本实施例提供一种反硝化菌的分离方法，该方法具体如下步骤1，采集颗粒污泥溶液为原料选取生活污水厂的缺氧池中的颗粒污泥溶液作为分离源；步骤2，对采集的颗粒污泥溶液原料进行处理，用漩涡振荡器振荡破碎颗粒污泥溶液中的颗粒污泥，制成菌悬液；步骤3，分离筛选培养将步骤2中制成的菌悬液转入分离筛选培养基，可用涂布方式涂布在分离筛选培养基上；采用焦性没食子酸法，在25 35°C温度下厌氧培养10 15天，培养后得到分离筛选培养物；上述步骤3中的分离筛选培养基由下述原料组成蒸馏水lOOOmL、柠檬酸钠4g 6g、硝酸钾I. 7g 2. 3g、磷酸氢二钾O. 8g I. 2g、磷酸二氢钾O. 8g I. 2g、七水硫酸镁O. Ig O. 2g和微量元素溶液2mL ;分离筛选培养基的pH值为7. O 7. 2。上述反硝化分离筛选培养基中的微量元素溶液由下述各原料按重量份组成蒸馏水lOOOmL、乙二胺四乙酸(EDTA) 40g 50g、氯化I丐5g 6g、五水硫酸铜Ig 2g、四水氯化猛4. 5g 6g、七水硫酸亚铁4g 6g和六水氯化钴Ig 2g ;微量元素溶液的pH值为7. O 7. 2。上述步骤3的分离筛选培养中，采用的焦性没食子酸法具体如下取一块培养皿皿盖(或玻璃板)，洗净，干燥后灭菌，铺上一薄层灭菌脱脂棉或纱布，将Ig的焦性没食子酸放在脱脂棉或纱布上；焦性没食子酸(Pyrogallic Acid)，购买自国药集团化学试剂有限公司；滴加质量浓度为10%的NaOH溶液I. 5 2. 5ml于脱脂棉或纱布上的焦性没食子酸上，将溶液控制在脱脂棉或纱布内，将培养皿皿盖覆盖于装有已接种菌悬液的分离筛选培养基的培养皿上，并将脱脂棉或纱布全部罩住培养皿的皿口，并保证焦性没食子酸反应物不能与培养基表面接触，用溶化的石蜡凡士林液密封培养皿的皿口与皿盖的接触处，使已接种菌悬液的分离筛选培养基在密封的由焦性没食子酸与NaOH溶液反应形成的厌氧环境下进行培养。步骤4，培养物检测采用厌氧滚管培养法，将上述步骤3的分离筛选得到的培养物，接入检测培养基，在30 40°C温度下厌氧培养3 5天；利用国标方法检测培养物中硝酸盐的消失情况，检测结果为硝酸盐消失了 89. 7%，则可以确认该培养物中的菌株为合格的反硝化菌。也可以采用实施例一中给出的第(2)种测检测培养基中总氮的方法，确认培养物是否合格，若合格则培养物中的菌株为合格的反硝化菌。上述步骤4中，所用的检测培养基由下述原料组成蒸馏水lOOOmL、柠檬酸钠4g 6g、硝酸钾I. 7g 2. 3g、磷酸氢二钾O. 8g I. 2g、磷酸二氢钾O. 8g I. 2g、七水硫酸镁O. Ig O. 2g和微量元素溶液2mL。进一步可以加入质量浓度为1%的溴百里酚蓝ImL作为指示剂。加入指示剂后，接入培养物并经厌氧滚管培养法培养后的检测培养基的颜色可由蓝变绿再变黄(表示合格)，从而给出直观的检测结果。上述步骤4中，采用的厌氧滚管培养法具体如下
将装有检测培养基的试管放置于40 60°C的恒温水浴中，用Iml无菌注射器吸取分离筛选培养物(菌悬液)O. Iml于检测培养基试管中，而后将试管放于滚管机上迅速滚动，使带菌的检测培养基在试管内壁立即凝固成一薄层，处理后将试管置于30 40°C的恒温培养箱中进行培养。为保证复筛效果，可在处理重复上述处理进行3次或5次，制成多个内壁凝固成一薄层试管同时进行培养。本实施例的分离方法中以在生活污水厂的缺氧池采集的污泥为原料，制成菌悬液后，依次经分离筛选培养和检测培养后，即可分离得到反硝化菌。该方法步骤简单，可实现从颗粒污泥快速分离反硝化菌，具有简单、快速的优点。实施例3本实施例提供一种反硝化菌的分离方法，该方法具体如下步骤I,采集颗粒污泥溶液为原料选取上流式厌氧污泥床(upflow anaerobicsludge blanket, UASB)中的污泥溶液作为分离源；步骤2，对采集的原料进行处理，用漩涡振荡器振荡破碎污泥溶液中的颗粒污泥，制成菌悬液；步骤3，分离筛选培养将步骤2中制成的菌悬液转入分离筛选培养基中，采用焦性没食子酸法，在25 35°C温度下厌氧培养10 15天，培养后得到培养物；上述步骤3中的分离筛选培养基由下述原料组成蒸馏水1000ml、柠檬酸钠4g 6g、硝酸钾I. 7g 2. 3g、磷酸氢二钾0. 8g I. 2g、磷酸二氢钾0. 8g I. 2g、七水硫酸镁0. Ig 0. 2g、微量元素溶液3mL ;分离筛选培养基的pH值为7. O 7. 2。上述分离筛选培养基中的微量元素溶液由下述各原料按重量份组成蒸馏水1000mL、乙二胺四乙酸(EDTA)40g 50g、氯化I丐5g 6g、五水硫酸铜Ig 2g、四水氯化猛4. 5g 6g、七水硫酸亚铁4g 6g和六水氯化钴Ig 2g ;微量元素溶液的pH值为7. O 7. 2。上述步骤3中采用的焦性没食子酸法与实施例I或2的步骤3中采用的焦性没食子酸法基本相同在此不再重复说明。步骤4、采用厌氧滚管培养法，将上述步骤3的分离筛选培养后得到的培养物接入检测培养基，在30 40°C温度下厌氧培养3 5在，利用国标方法检测培养后得到培养物中硝酸盐的消失情况，结果为硝酸盐消失了 90. 4%，可确认该培养物中的菌株为合格的反硝化菌。
上述步骤4中的检测培养基由下述原料组成蒸懼水lOOOmL、朽1檬酸钠4g 6g、硝酸钾I. 7g 2. 3g、磷酸氢二钾O. 8g I. 2g、磷酸二氢钾O. 8g I. 2g、七水硫酸镁
O.Ig O. 2g和微量兀素溶液3mL (微量兀素溶液与分离筛选培养基中的微量兀素溶液相同)。上述步骤4中采用的厌氧滚管培养法与实施例I或2的步骤4中采用的厌氧滚管培养法基本相同在此不再重复说明。通过将上述实施例1、2、3可知，所得到的反硝化菌菌株的硝酸盐的消失情况相差不大，且在加入指示剂的情况下培养基的颜色由蓝变绿再变黄，即认为所得到的菌都是反硝化菌。利用本发明实施例分离反硝化菌的优点是(1)可以获得反硝化菌的纯培养物，为微生物学理论研究和工业化应用提供帮助；(2)所得到的菌株便于保藏和运输。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
权利要求
1.一种反硝化菌的分离方法，其特征在于，该方法包括 米集原料米集颗粒污泥溶液为原料，将所述颗粒污泥溶液制成囷悬液； 分离筛选培养对制成的所述菌悬液进行分离筛选培养，培养后得到培养物； 培养物检测对分离筛选培养后得到的培养物进行检测，检测合格的培养物中的菌株即为反硝化菌。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述采集原料步骤中，采集的作为原料的颗粒污泥溶液为取自上流式厌氧污泥床中或生活污水处理厂缺氧池内； 所述将所述颗粒污泥溶液制成菌悬液为用漩涡振荡器将采集的颗粒污泥溶液原料中的颗粒污泥振荡破碎后，制成菌悬液。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述分离筛选培养步骤中，对制成的所述菌悬液进行分离筛选培养包括 将所述菌悬液转入分离筛选培养基中，采用焦性没食子酸法，在25 35°C温度下厌氧培养5 7天，培养后得到培养物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分离筛选培养基由下述各原料按重量份组成蒸馏水1000份、柠檬酸钠4 6份、硝酸钾I. 7 2. 3份、磷酸氢二钾0. 8 I. 2份、磷酸二氢钾0. 8 I. 2份、七水硫酸镁0. I 0. 2份和微量元素溶液I 3份；分离筛选培养基的PH值为7. 0 7. 2。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述采用的焦性没食子酸法为 在干燥无菌的培养皿皿盖上，铺设一层灭菌脱脂棉或纱布，将焦性没食子酸设置在所述脱脂棉或纱布上； 向所述焦性没食子酸上滴加氢氧化钠溶液后，将所述培养皿皿盖覆盖于装有已接种所述菌悬液的分离筛选培养基的培养皿上，使设有焦性没食子酸和氢氧化钠溶液的所述脱脂棉或纱布全部罩住培养皿的皿口，以溶化的石蜡或凡士林液密封培养皿的皿口与皿盖的接触处，使所述菌悬液在密闭的由焦性没食子酸与氢氧化钠溶液反应形成的厌氧环境下在分离筛选培养基中进行培养。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述对分离筛选培养后得到的培养物进行检测，检测合格的培养物的菌株即为反硝化菌包括 采用厌氧滚管培养法，将分离筛选培养培养后得到的培养物接入检测培养基，在30 40°C温度下厌氧培养3 5天，对检测培养基中硝酸盐的质量浓度进行检测； 若检测培养基中硝酸盐的质量浓度不高于30%,则确认检测培养物合格,合格的培养物中的菌株即为反硝化菌； 或者 先测得检测培养基总氮含量的第一含量值； 采用厌氧滚管培养法，将分离筛选培养培养后得到的培养物接入检测培养基，在30 40°C温度下厌氧培养3 5天，对检测培养基中总氮含量进行检测得到第二含量值； 若测得的检测培养基中总氮的第二含量值相比第一含量值降低的量大于等于10%，则确认检测培养物合格，合格的培养物中的菌株即为反硝化菌。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用的厌氧滚管培养法为 将装有检测培养基的试管放置于40 60°C的恒温水浴中，用无菌注射器吸取分离筛选的培养物转入所述试管内的检测培养基中，而后将所述试管放于滚管机上进行滚动，使带有所述培养物的检测培养基在所述试管内壁凝固形成薄层，处理后将所述试管置于30 40 °C的恒温培养箱中进行培养。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测培养基由下述原料按重量份组成蒸馏水1000份、柠檬酸钠4 6份、硝酸钾I. 7 2. 3份、磷酸氢二钾0. 8 I. 2份、磷酸二氢钾0. 8 I. 2份、七水硫酸镁0. I 0. 2份和微量元素溶液I 3份。
9.如权利要求4或8所述的方法，其特征在于，所述微量元素溶液由下述各原料按重量份组成蒸馏水1000份、乙二胺四乙酸(EDTA) 40 50份、氯化钙5 6份、五水硫酸铜I 2份、四水氯化猛4. 5 6份、七水硫酸亚铁4 6份和六水氯化钴I 2份；微量元素溶液的PH值为7.0 7. 2。
全文摘要
本发明公开了一种反硝化菌的分离方法，属于细菌分离领域。该方法包括采集原料采集颗粒污泥溶液为原料，将所述颗粒污泥溶液制成菌悬液；分离筛选培养对制成的所述菌悬液进行分离筛选培养，培养后得到培养物；培养物检测对分离筛选培养后得到的培养物进行检测，检测合格的培养物中的菌株即为反硝化菌。该分离方法不但具有简单、快速分离反硝化菌的优点，且可以获得反硝化菌的纯培养物，为微生物学理论研究和工业化应用提供帮助。
文档编号C12N1/02GK102703366SQ201210240700
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月11日 优先权日2012年7月11日
发明者屈佳玉 申请人:桑德集团有限公司