专利名称：一种大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及ー种大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其应用。
背景技术：
大黄鱼(Pseudosciaena crocea),又名黄鱼、黄花鱼，隶属于S卢形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaenidae)、黄鱼属(Pseudosciaena),是我国海洋捕捞主要经济鱼类之一，是中国海水网箱养殖产量最大的鱼类品种。我国沿海大黄鱼大致分为岱衢族、闽-粤东族、硇洲族三个地理种群。岱衢族大黄鱼呈金黄或虎黄色，有光泽，鳃丝清晰呈鲜红或紫红色，眼球饱满，肌肉结实，富有弾性，是黄鱼族中的极品，其主要分布在浙北舟山岱衢洋渔场，由于过量捕捞，环境恶化，目前野生岱衢族大黄鱼十分稀少。由于闽-粤东族 大黄鱼和岱衢族大黄鱼外部形态相似，很难进行区分，市场上ー些商户甚至将闽-粤东族大黄鱼和岱衢族大黄鱼混淆销售，欺诈消费者，因此将外形上相似的大黄鱼进行物种鉴定显得十分必要。目前，通过序列差异来鉴别外形上相似的鱼类是ー种十分便利准确的方法，其中线粒体序列差异的研究是其中重要的ー种方法。线粒体是细胞内的重要细胞器，属于母性遗传并具有自身的ー套基因组，是半自主性细胞器，且由于其结构简单、几乎不发生重组、进化速度快、不同区域进化速度存在差异等特点，使其在种类鉴别、系统进化和种群遗传学的研究方面应用十分广泛。不同生物线粒体基因组在结构、基因数和基因排列方式等方面均显示出极大的多样性，因此线粒体基因组的全序列研究成为动物分子系统发生最有力的证据。中国专利名称为哲罗鲑线粒体全基因组序列及其扩增引物(申请号CN200910073114. 8)，黑龙江省野猪线粒体基因组全序列克隆及进化分析(申请号CN200810172959.8)等分别对线粒体全基因组进行了测序，而不同地理种群的大黄鱼(如闽-粤东族大黄鱼和岱衢族大黄鱼)的线粒体全基因组序列到目前为止仍未測定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供ー种大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其应用，利用该扩增引物可获得不同种类的大黄鱼的线粒体全基因组序列及大黄鱼高变异区域扩增引物，为大黄鱼的保护遗传学、进化遗传学及其物种的分子鉴定提供物质基础。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为ー种大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物为15对，基因序列分别如下所示(I)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第I对的上游引物为5' -AGTCAACGGCGTAAAGAGTGG-3'，下游引物为5' -TACCCTTCTGGGAAAGTTGT-3'；(2)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第2对的上游引物为5' -CCTGGGAAATGAATAGAAGT-3'，下游引物为5' -AAAATCATGGCATAGATAGA-3'；(3)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第3对的上游引物为5' -TTACGACCTCGATGTTGGATCAG-3'，下游引物为5' -GGAAGCACTAGGAGTTTTGAGT-3'(4)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第4对的上游引物为5' -AAGGGCCACTTTGATAGAGTG-3'，下游引物为5' -GTGAGTGCGGGGGTTTTGGCTCA-3'；(5)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第5对的上游引物为5' -TTGCCTACTCCTCAATTGCCCAC-3'，下游引物为5' -CTTATGTTATTCATTCGGGGGAA-3'；(6)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第6对的上游引物为5' -CCTCTACCTAATTTTTGGTGC-3'，下游引物为5' -ATGCGGTTGGCTTGAAATCAA-3'；(7)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第7对的上游引物为
5' -AGCACTTGAACAAAAGCTCACTT-3 '，下游引物为5 ' -GTCGAAGAGGCTTACAGTCATGGTCA-3
I(8)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第8对的上游引物为5' -GCAAGCGTTAGCCTTTTAAGC-3'，下游引物为5' -CAGGGGCTGGGGTCTACTAT-3'；(9)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第9对的上游引物为5' -CCTACACTTCTTATCCCTAITCTAAT-3'，下游引物为5' -GGAGAAAGGGAGGCGAGCGGT-3'；(10)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第10对的上游引物为5' -AGTATTAGTGACTTCCAATCA-3'，下游引物为5' -TGTAGAATAGAAAATAAGTGCC-3'；(11)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第11对的上游引物为5' -CCTCTTAACATCCCTGCAAATC-3'，下游引物为5' -TTCCTAAGACCAACGGATGAGC-3'；(12)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第12对的上游引物为5' -AAAACATTAGATTGTGATTCTAA-3'，下游引物为5' -GACTCGGAGGCTGTAAATAG-3'；(13)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第13对的上游引物为5' -GCCTGGCCCTCACTGGTACC-3'，下游引物为5' -AGCGGGTGGGTTTTGCGTAG-3'；(14)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第14对的上游引物为5' -CTCTAACCAGGACTAATGGCTTG-3'，下游引物为5' -TGATTATCAATCAATGTCCC-3'；(15)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第15对的上游引物为5' -TCAACATTAATTACCACGCT-3'，下游引物为5' -GGGGTATCTAATCCCAGTTT-3'。ー种大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物的应用，利用所述的扩增引物获得的岱衢族大黄鱼线粒体全基因组序列如SEQ ID NO:31所示。ー种大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物的应用，利用所述的扩增引物获得的闽-粤东族大黄鱼线粒体全基因组序列如SEQ ID NO: 32所示。ー种大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物的应用，利用所述的扩增引物获得的大黄鱼高变异区域扩增引物，基因序列如下BI 上游引物 5' -AGACCTTCTAGGCTTTGCAATC-3'，BI 下游引物 5' -GGAGCTTTCTAGGGCTCATCT-3'；B2 上游引物5' -TTATTTTCTATTCTACACCCTGGC-3'，B2 下游引物 5' -AGAGGGAATACCCCGCTGT-3'。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明首次公开了大黄鱼线粒体全基因组序列的15对扩增引物，15对扩增引物对大黄鱼样本进行PCR扩增，分别获得片段大小在900-1560bp之间的特异性扩增产物，无需高质量的DNA模板和长链PCR技术，克隆的成功率高，而且每对引物扩增所获得的产物不需步移法直接测序即可测通；相邻区域扩增产物的序列有SObp以上的重叠部分，方便测序结果的拼接，可以快速、高效的分别获取岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼线粒体全基因组序列，并将不同大黄鱼进行同源序列比对，对大黄鱼高变异区域序列进行分析获得大黄鱼高变异区扩增引物，为大黄鱼的种类鉴定、地理种群鉴别、种质资源和遗传多祥性的研究提供支持，为进ー步开发岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别技术提供基础。
图I为岱衢族大黄鱼PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果示意图；图2为闽-粤东族大黄鱼PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果示意图。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进ー步详细描述。具体实施例一本发明大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物为15对，基因序列如下所示本发明所设计的引物的扩增产物应覆盖整个线粒体全基因组，每对引物的扩增产物长度在900-1560bp，且相邻两对引物获得的序列重叠为80bp以上。
权利要求
1.ー种大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物，其特征在于大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物为15对，基因序列分别如下所示 (1)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第I对的上游引物为5' -AGTCAACGGCGTAAAGAGTGG-3'，下游引物为5' -TACCCTTCTGGGAAAGTTGT-3'； (2)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第2对的上游引物为5' -CCTGGGAAATGAATAGAAGT-3'，下游引物为5' -AAAATCATGGCATAGATAGA-3'； (3)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第3对的上游引物为5' -TTACGACCTCGATGTTGGATCAG-3'，下游引物为5' -GGAAGCACTAGGAGTTTTGAGT-3' (4)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第4对的上游引物为5' -AAGGGCCACTTTGATAGAGTG-3'，下游引物为5' -GTGAGTGCGGGGGTTTTGGCTCA-3'； (5)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第5对的上游引物为5' -TTGCCTACTCCTCAATTGCCCAC-3'，下游引物为5' -CTTATGTTATTCATTCGGGGGAA-3'； (6)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第6对的上游引物为5' -CCTCTACCTAATTTTTGGTGC-3'，下游引物为5' -ATGCGGTTGGCTTGAAATCAA-3'； (7)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第7对的上游引物为5' -AGCACTTGAACAAAAGCTCACTT-3'，下游引物为5' GTCGAAGAGGCTTACAGTCATGGTCA-3' (8)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第8对的上游引物为5' -GCAAGCGTTAGCCTTTTAAGC-3'，下游引物为5' -CAGGGGCTGGGGTCTACTAT-3'； (9)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第9对的上游引物为5'-CCTACACTTCTTATCCCTATTCTAAT-3'，下游引物为5' GGAGAAAGGGAGGCGAGCGGT-3'； (10)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第10对的上游引物为5' -AGTATTAGTGACTTCCAATCA-3'，下游引物为5' -TGTAGAATAGAAAATAAGTGCC-3'； (11)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第11对的上游引物为5' -CCTCTTAACATCCCTGCAAATC-3'，下游引物为5' -TTCCTAAGACCAACGGATGAGC-3'； (12)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第12对的上游引物为5' -AAAACATTAGATTGTGATTCTAA-3'，下游引物为5' -GACTCGGAGGCTGTAAATAG-3'； (13)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第13对的上游引物为5' -GCCTGGCCCTCACTGGTACC-3'，下游引物为5' -AGCGGGTGGGTTTTGCGTAG-3'； (14)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第14对的上游引物为5' -CTCTAACCAGGACTAATGGCTTG-3'，下游引物为5' -TGATTATCAATCAATGTCCC-3'； (15)大黄鱼线粒体全基因组序列扩增引物第15对的上游引物为5' -TCAACATTAATTACCACGCT-3'，下游引物为5' -GGGGTATCTAATCCCAGTTT-3'。
2.—种权利要求I所述的大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物的应用，其特征在干利用所述的扩增引物获得的岱衢族大黄鱼线粒体全基因组序列如SEQ ID NO:31所示。
3.—种权利要求I所述的大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物的应用，其特征在干利用所述的扩增引物获得的闽-粤东族大黄鱼线粒体全基因组序列如SEQ ID NO:32所/Jn o
4.一种权利要求I所述的大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物的应用，其特征在于利用所述的扩增引物获得的大黄鱼高变异区域扩增引物，基因序列如下 BI 上游引物 5' -AGACCTTCTAGGCTTTGCAATC-3'， BI 下游引物 5' -GGAGCTTTCTAGGGCTCATCT-3'；B2 上游引物 5' -TTATTTTCTATTCTACACCCTGGC-3'， B2 下游引物 5' -AGAGGGAATACCCCGCTGT-3'。
全文摘要
本发明公开了一种大黄鱼线粒体全基因组序列的扩增引物及其应用，特点是其扩增引物为15对，基因序列分别如SEQ ID NO:1-30所示，还利用该扩增引物获得岱衢族大黄鱼线粒体全基因组序列和闽-粤东族大黄鱼线粒体全基因组序列分别如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示，并获得了大黄鱼高变异区域扩增引物，优点是通过上述15对扩增引物可以快速、高效的分别获取岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼线粒体全基因组序列，及大黄鱼高变异区域扩增引物，为大黄鱼的种类鉴定、地理种群鉴别、种质资源和遗传多样性的研究提供支持，为进一步开发岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的鉴别技术提供基础。
文档编号C12Q1/68GK102776183SQ20121024149
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者严小军, 沈锡权, 王梦林, 闫旭红 申请人:宁波大学