专利名称：一种海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛭弧菌的发酵生产エ艺,尤其涉及ー种海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产エ艺。
背景技术：
噬菌蛭弧菌作为一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有独特的裂解细菌的生物学特性，可将致病菌数量限制在较低水平，同时又可以有效地控制养殖水体的C0D、硫化物和氨氮等的含量。因此，利用它作为养殖水体环境中的天然生物浄化因子和“活性抗生素”，对开拓水产动物病害生物防治新途径具有重要的意义。目前，市场上的生产厂家，用淡水蛭弧菌产品代替海水专用蛭弧菌产品，这样的蛭弧菌产品，蛭弧菌含量不足、保存时间 过短，不利于生产和使用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供ー种海水养殖专用蛭弧菌发酵生产エ艺，以达到生产出来的蛭弧菌产品，蛭弧菌含量高、保存时间长久。本发明的海水养殖专用蛭弧菌发酵生产エ艺适用于I飞吨发酵罐。为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为
ー种海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产エ艺，包括宿主菌培养和噬菌蛭弧菌培养，其中所述宿主菌培养，包括以下步骤(1) ー级摇瓶种子培养一将经活化处理后的宿主菌接种于盛装有培养基的一级摇瓶中，在温度33土TC、转速18(Γ220转/分的条件下培养18 24h，即制得一级摇瓶宿主菌种子；(2) ニ级摇瓶种子培养——在盛装有培养基的ニ级摇瓶中接入步骤(I)培养好的一级摇瓶宿主菌种子，在温度33 土 1°C、转速18(Γ220转/分的条件下培养18 24h，即制得ニ级摇瓶种子；(3)种子罐培养——将步骤(2)培养好的 ニ级摇瓶种子按照1°/Γ3%的体积比接入盛装有培养基的种子罐中，在罐温37土TC、罐压O. 045 O. 55 MPa、搅拌转速80 120转/分的条件下培养18 24h即制得宿主菌种子液；(4)发酵罐培养一在盛装有培养基的发酵罐中接入步骤(3)培养好的宿主菌种子液，在罐温35±1°C、罐压O. 05 MPa、搅拌转速80 100转/分的条件下培养16 24h即可；
宿主菌培养过程中，在向ー级摇瓶、ニ级摇瓶、种子罐以及发酵罐的培养基接种前，盛装有相应培养基的ー级摇瓶、ニ级摇瓶、种子罐以及发酵罐均经过灭菌处理；
所述噬菌蛭弧菌培养，包括以下步骤1)将经活化处理后的噬菌蛭弧菌接种于培养好一级摇瓶宿主菌种子的一级摇瓶中，在温度33±1°C、摇瓶转速18(Γ220转/分的条件下培养18 24h，即制得ー级摇瓶噬菌蛭弧菌；2)在培养好ニ级摇瓶种子的ニ级摇瓶中，接入步骤I)培养好的ー级摇瓶噬菌蛭弧菌，在温度33土1°C、摇瓶转速18(Γ220转/分的条件下培养18 24h，即制得ニ级摇瓶噬菌蛭弧菌；3)在培养好宿主菌种子液的种子罐中，按1°/Γ5%的体积比接入步骤2)培养好的ニ级摇瓶噬菌蛭弧菌，在温度33± 1°C、罐压O. 05 MPa、搅拌转速8(Γ100转/分的条件下培养16 24h，即制得噬菌蛭弧菌种子液；4)在已培养好宿主菌的发酵罐中，按39Γ5%的体积比接入步骤3)培养好的噬菌蛭弧菌种子液，在罐温33±1°C、罐压O. 05 MPa、搅拌转速8(Tl00转/分的条件下，培养72 96h，即制得蛭弧菌菌液；
一级摇瓶的培养基配方为氯化钠O. 4^0. 6 g/Ι ;酵母粉O. 2^0. 4 g/Ι ;蛋白胨或胰蛋白胨O. 4^0. 6g/l ;该培养基的pH为6. 5^6. 8 ；
ニ级摇瓶的培养基配方为氯化钠O. Γ0.6 g/Ι ;酵母粉O. 2 0.4 g/Ι;蛋白胨
O. 4 0. 6g/l ;该培养基的pH为6. 5 6. 8 ；
种子罐的培养基配方为氯化钠O. 18^0. 22 g/Ι ;酵母粉O. 08、. 12 g/Ι ;蛋白胨或胰蛋白胨O. 18 O. 22 g/Ι ;消泡剂O. 009 O. 011 g/Ι ;该培养基的pH为7. 0 7. 2 ；
发酵罐的培养基配方为氯化钠O. 18^0. 22 g/Ι ;酵母粉O. 08、. 12 g/Ι ;蛋白胨或胰蛋白胨O. 18 O. 22 g/Ι ;消泡剂O. 018 O. 022 g/Ι ;该培养基的pH为6. 5 6. 8。本エ艺中，所述宿主菌为大肠杆菌、非致病性的嗜水气单胞菌或假单胞菌。本エ艺中，ー级摇瓶、ニ级摇瓶、种子罐以及发酵罐的培养基所采用的pH调节试剂均为NaOH溶液。本エ艺中，种子罐以及发酵罐培养基配方中所采用的消泡剂均为水溶性硅油。本エ艺中，ー级摇瓶、ニ级摇瓶、种子罐以及发酵罐的培养基灭菌条件为在
O.lMPa、121°C的条件下历时20min。本エ艺中，接入一级摇瓶中的宿主菌以及噬菌蛭弧菌均为菌悬液；所述宿主菌菌悬液的制备方法为先采用常规方法制取斜面宿主菌，然后取斜面宿主菌I支，加入8 12ml无菌水，即可制成宿主菌菌悬液；所述噬菌蛭弧菌菌悬液的制备方法为先采用常规方法制取斜面噬菌蛭弧菌，取斜面噬菌蛭弧菌ー支，加入8^12ml无菌水，即可制成噬菌蛭弧菌菌悬液。另外，本エ艺中，还可以采用接种环进行一级摇瓶中的宿主菌以及噬菌蛭弧菌接种操作，而无需采用菌悬液。本エ艺中，一级摇瓶的培养基装量为8(Tll0ml/250ml培养瓶，而ー级摇瓶中宿主菌菌悬液接种量为O. 4^0. 6ml/瓶、噬菌蛭弧菌菌悬液接种量为l_3ml/瓶；ニ级摇瓶的培养基装量为18(T220ml/500ml培养瓶，而ニ级摇瓶中一级摇瓶宿主菌种子、一级摇瓶噬菌蛭弧菌的接种量均为f 3ml/瓶。本エ艺的发酵罐培养结束时，发酵液变清，取样直接检测，在560nm下的吸光度值(OD)在O. 8以下，如果培养基配方中采用胰胨代替蛋白胨，则560nm下的吸光度值将在O. 5以下；蛭弧菌计数在IO6个/ml以上，尤其集中在107 108个/ml。因此，本发明提供的海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产エ艺，步骤少，操作简单，利于エ业化生产。所制备的噬菌蛭弧菌产品，菌体含量高，能够达到10卜108个/ml，产品的保存时间长，在一年以上，易于使用。本发明的海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产エ艺特别适用于I飞吨发酵罐的生产。
具体实施例方式以下将结合各实施例详细地说明本发明的技术方案。但是本发明的保护范围不能认为仅局限于下述具体实施例。对于所述技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的基本前提下，还可以作出若干简单推演或者等同替换，这些等同替换方案仍然将被视为本发明的保护范围之列。
本发明所述的宿主菌可以为大肠杆菌、非致病性的嗜水气单胞菌、假单胞菌或者其它能够作为嗤囷輕弧囷宿王的细囷；所涉及的嗤囷輕弧囷均为保减于中国微生物囷种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)、保藏编号为CGMCC No. 1045饱Bdellovibriosp · S-23。实施例I
选择大肠杆菌为噬菌蛭弧菌的宿主菌。(I)大肠杆菌的培养
配制斜面固体培养基150ml，配方为:蛋白胨，O. 5g/l ;牛肉膏，3g/l ;氯化钠，O. 5g/l ；琼脂，1.8g/l ;用NaOH溶液调节固体培养基的pH至7.0 ;0. IMPa，121°C，灭菌20min，分装
10支试管，冷却凝固；挑取平板上的大肠杆菌单菌落，接种斜面，控温37± I°C，培养24h，即 制备出斜面大肠杆菌；
按配方为氯化钠O. 5 g/Ι、酵母粉O. 3 g/Ι、蛋白胨O. 5g/l制备出ー级摇瓶种子培养基2L，调节培养基的pH至6. 5 ;在250ml培养瓶中分装，每瓶IOOml培养基，共20瓶；取斜面大肠杆菌I支，加入IOml无菌水，制成菌悬液，按O. 5ml/瓶接入种子瓶，共20瓶；控温33±1°C，摇瓶转速200转/分，培养24h，即制得一级摇瓶大肠杆菌种子；
按配方为氯化钠O. 5 g/Ι、酵母粉O. 3 g/Ι、蛋白胨O. 5g/l制备出ニ级摇瓶种子培养基2L，调节培养基的pH至6. 5 ;在500ml培养瓶中分装，每瓶200ml培养基，共10瓶；取一级摇瓶大肠杆菌种子I瓶，按3ml/瓶接入ニ级摇瓶种子瓶，共10瓶；控温33 ± I °C，摇瓶转速200转/分，培养24h，即制得ニ级摇瓶大肠杆菌种子；
按配方为氯化钠O. 2 g/Ι ;酵母粉O. I g/Ι ;蛋白胨O. 2 g/Ι ;水溶性硅油O. 01 g/
I;用氢氧化钠调节培养基的pH至7. (Γ7. 2，配制150L种子罐培养基，在O. lMPa，121°C的条件下灭菌20min ;在种子罐培养基中接入已经培养好的ニ级摇瓶大肠杆菌I. 5L，控制罐温37± I°C，通空气，控制罐压O. 045 O. 55 MPa,搅拌转速100转/分，培养24h，即制得大肠杆菌种子液；
按配方为氯化钠O. 2 g/Ι ;酵母粉O. I g/Ι ;蛋白胨O. 2 g/Ι ;水溶性硅油O. 02 g/Ι ；用氢氧化钠调节培养基的pH至6. 5飞.8 ;配制发酵罐培养基700L，在O. IMPa, 121 °C的条件下灭菌20min ;在发酵罐中接入大肠杆菌种子液21L，控制罐温35 土 1°C，通空气，控制罐压
O.05 MPa,搅拌转速80^100转/分，培养24h，即可；
(2)噬菌蛭弧菌培养
配制斜面固体培养基150ml,配方为:蛋白胨O. 5g/l ;牛肉膏3g/l ;氯化钠O. 5g/l ;琼脂1.8g/l ;用NaOH溶液调节固体培养基的pH至7.0 ;于O. IMPa、121°C下，灭菌20min，分装10支试管，冷却凝固；挑取平板上的噬菌蛭弧菌单菌落，接种斜面，控温37± I°C，培养24h，即制备出斜面噬菌蛭弧菌；
取斜面噬菌蛭弧菌I支，加入IOml无菌水，制成菌悬液，按Iml/瓶接入培养好的ー级摇瓶大肠杆菌种子瓶，控温33±1°C,摇瓶培养24h,即制得一级摇瓶卩遼菌蛭弧菌；取培养好的ー级摇瓶噬菌蛭弧菌，按Iml/瓶接入培养好的ニ级摇瓶大肠杆菌种子瓶，控温33 ± I °C，摇瓶培养24h，即制得ニ级摇瓶噬菌蛭弧菌；
在培养好的大肠杆菌种子罐中，接入I. 5L ニ级摇瓶噬菌蛭弧菌，控制罐温33± I°C，通空气，控制罐压O. 05 MPa，搅拌转速8(Tl00转/分，培养24h，即制得噬菌蛭弧菌种子液。
在已培养好的大肠杆菌发酵罐中，移入噬菌蛭弧菌种子液21L，控制罐温33± I°C，通空气，控制罐压O. 05 MPa,搅拌转速80^100转/分，培养96h。在蛭弧菌培养中，当上ー级蛭弧菌含量超过IO6吋，即可接种到下ー级发酵罐(或大的三角瓶)中，毎次接种量的体积比优选为19Γ5%;实验室培养阶段的接种量的体积比更优选为1°/Γ3% ;而最后一个生产用的大罐的接种量的体积比优选为39Γ5%。取样检测，得出每Iml菌液中含有IO8以上个蛭弧菌，取样直接检测560nm下的OD值为O. 556 ;产品经保存，时间在一年以上。实施例2
选择非致病性的嗜水气单胞菌为噬菌蛭弧菌的宿主菌。
( I)非致病性的嗜水气单胞菌的培养
配制斜面固体培养基150ml，配方为:蛋白胨，O. 4g/l ;牛肉膏，3. 5g/l ;氯化钠，O. 6g/I ;琼脂，1.7g/l ;用NaOH溶液调节固体培养基的pH至7. I ；0. lMPa，121°C，灭菌20min,分装10支试管，冷却凝固；挑取平板上的非致病性的嗜水气单胞菌单菌落，接种斜面，控温37± 1°C，培养30h，即制备出斜面非致病性的嗜水气单胞菌；
按配方为氯化钠O. 4 g/Ι、酵母粉O. 4 g/Ι、蛋白胨O. 4g/l制备出ー级摇瓶种子培养基O. 8L，调节培养基的pH至6. 8 ;在250ml培养瓶中分装，每瓶80ml培养基，共10瓶；取斜面非致病性的嗜水气单胞菌I支，加入12ml无菌水，制成菌悬液，按O. 6ml/瓶接入种子瓶，共10瓶；控温33±1°C，摇瓶转速220转/分，培养20h，即制得一级摇瓶非致病性的嗜水气单胞菌种子；
按配方为氯化钠O. 4 g/Ι、酵母粉O. 4 g/Ι、蛋白胨O. 4g/l制备出ニ级摇瓶种子培养基I. 8L，调节培养基的pH至6. 8 ;在500ml培养瓶中分装，每瓶180ml培养基，共10瓶；取一级摇瓶非致病性的嗜水气单胞菌种子I瓶，按Iml/瓶接入ニ级摇瓶种子瓶，共10瓶；控温33土 1°C，摇瓶转速220转/分，培养20h，即制得ニ级摇瓶非致病性的嗜水气单胞菌种子;
按配方为氯化钠O. 22 g/Ι ;酵母粉O. 08 g/Ι ;蛋白胨，O. 22 g/Ι ;水溶性硅油O. 011g/Ι ;用氢氧化钠调节培养基的pH至7. 0 7.2，配制100L种子罐培养基，在O. IMPa, 121°C的条件下灭菌20min ;在种子罐培养基中接入已经培养好的ニ级摇瓶种子I. 5L，控制罐温37± I°C，通空气，控制罐压O. 045 O. 55 MPa,搅拌转速120转/分，培养18h，即制得非致病性的嗜水气单胞菌种子液；
按配方为氯化钠O. 22 g/Ι ;酵母粉O. 12 g/Ι ;蛋白胨，O. 18 g/Ι ;水溶性硅油，O. 022g/Ι ;用氢氧化钠调节培养基的pH至6. 5飞.8 ;配制发酵罐培养基700L，在O. IMPa, 121°C的条件下灭菌20min ;在发酵罐中接入非致病性的嗜水气单胞菌种子液28L，控制罐温35±1°C，通空气，控制罐压O. 05 MPa，搅拌转速80 100转/分，培养20h，即可；
(2)噬菌蛭弧菌培养
配制斜面固体培养基150ml，配方为:蛋白胨，O. 5g/l ;牛肉膏，3g/l ;氯化钠，O. 5g/l ；琼脂，1.8g/l ;用NaOH溶液调节固体培养基的pH至7.0 ;0. lMPa，121°C，灭菌20min，分装10支试管，冷却凝固；挑取平板上的噬菌蛭弧菌单菌落，接种斜面，控温37± I°C，培养24h，即制备出斜面噬菌蛭弧菌；
取斜面噬菌蛭弧菌I支，用接种环接种，按2环/瓶接入培养好的一级摇瓶非致病性的嗜水气单胞菌种子瓶，控温33 土 1°C，摇瓶培养18h，即制得ー级摇瓶噬菌蛭弧菌；取培养好的一级摇瓶噬菌蛭弧菌，按2ml/瓶接入培养好的ニ级摇瓶非致病性的嗜水气单胞菌种子瓶，控温33± 1°C，摇瓶培养20h，即制得ニ级摇瓶噬菌蛭弧菌；
在培养好的非致病性的嗜水气单胞菌的种子罐中，接入4. 5L ニ级摇瓶噬菌蛭弧菌，控制罐温33± I°C，通空气，控制罐压O. 05 MPa，搅拌转速80 100转/分，培养24h，即制得噬菌蛭弧菌种子液。在已培养好的非致病性的嗜水气单胞菌发酵罐中，移入噬菌蛭弧菌种子液30L，控制罐温33± I°C，通空气，控制罐压O. 05 MPa,搅拌转速8(Tl00转/分，培养72h。取样检测，得出每Iml菌液中含有IO7以上个蛭弧菌，取样直接检测560nm下的OD值为0914 ;产品经·保存，时间在一年以上。实施例3
选择假单胞菌为噬菌蛭弧菌的宿主菌。(I)假单胞菌的培养
配制斜面固体培养基150ml，配方为:蛋白胨，O. 6g/l ;牛肉膏，2. 5g/l ;氯化钠，O. 4g/
I;琼脂，I. 7g/l ;用NaOH溶液调节固体培养基的pH至7. 2 ；0. IMPa, 121°C，灭菌20min,分装10支试管，冷却凝固；挑取平板上的假单胞菌单菌落，接种斜面，控温37± I°C，培养36h，即制备出斜面假单胞菌；
按配方为氯化钠O. 6 g/Ι、酵母粉O. 2 g/Ι、胰蛋白胨O. 6g/l制备出ー级摇瓶种子培养基I. 1L，调节培养基的pH至6. 6 ;在250ml培养瓶中分装，每瓶IlOml培养基，共10瓶；取斜面假单胞菌I支，用接种环挑取广2环每瓶接入种子瓶，共10瓶；控温33±1°C，摇瓶转速180转/分，培养18h，即制得一级摇瓶假单胞菌种子；
按配方为氯化钠O. 6 g/Ι、酵母粉O. 2 g/Ι、胰蛋白胨O. 6g/l制备出ー级摇瓶种子培养基2. 2L，调节培养基的pH至6. 6 ;在500ml培养瓶中分装，每瓶220ml培养基，共10瓶；取一级摇瓶假单胞菌种子I瓶，按2ml/瓶接入ニ级摇瓶种子瓶，共10瓶；控温33 ± Iで，摇瓶转速180转/分，培养18h，即制得ニ级摇瓶假单胞菌种子；
按配方为氯化钠O. 18 g/Ι;酵母粉O. 12 g/Ι ;胰蛋白胨，O. 18 g/Ι ;水溶性硅油
O.009 g/Ι ;用氢氧化钠调节培养基的pH至7. 0 7· 2，配制170L种子罐培养基，在O. IMPa,121°C的条件下灭菌20min ;在种子罐培养基中接入已经培养好的ニ级摇瓶种子2. 1L，控制罐温37土 1°C，通空气，控制罐压O. 045 O. 55 MPa,搅拌转速80转/分，培养20h，即制得假单胞菌种子液；
按配方为氯化钠O. 18 g/Ι ;酵母粉O. 08 g/Ι ;蛋白胨，O. 22 g/Ι ;水溶性硅油，0.018g/Ι ;用氢氧化钠调节培养基的pH至6. 5飞.8 ;配制发酵罐培养基700L，在O. lMPa，121°C的条件下灭菌20min ;在发酵罐中接入假单胞菌种子液35L，控制罐温35± 1°C，通空气，控制罐压O. 05 MPa,搅拌转速80^100转/分，培养16h，即可；
(2)噬菌蛭弧菌培养
配制斜面固体培养基150ml，配方为:蛋白胨，O. 5g/l ;牛肉膏，3g/l ;氯化钠，O. 5g/l ；琼脂，1.8g/l ;用NaOH溶液调节固体培养基的pH至7.0 ;0. lMPa，121°C，灭菌20min，分装10支试管，冷却凝固；挑取平板上的噬菌蛭弧菌单菌落，接种斜面，控温37± I°C，培养24h，即制备出斜面噬菌蛭弧菌；取斜面噬菌蛭弧菌I支，用接种环接种，按2环/瓶接入培养好的ー级摇瓶假单胞菌种子瓶，控温33±1°C,摇瓶培养20h,即制得一级摇瓶卩遼菌蛭弧菌；取培养好的一级摇瓶卩遼菌蛭弧菌，按2ml/瓶接入培养好的ニ级摇瓶假单胞菌种子瓶，控温33 ± I °C，摇瓶培养18h，即制得ニ级摇瓶噬菌蛭弧菌；
在培养好的假单胞菌的种子罐中，接入3L ニ级摇瓶噬菌蛭弧菌，控制罐温33± I°C，通空气，控制罐压O. 05 MPa，搅拌转速8(Tl00转/分，培养24h，即制得噬菌蛭弧菌种子液。在已培养好的假单胞菌发酵罐中，移入噬菌蛭弧菌种子液30L，控制罐温33± I°C，通空气，控制罐压O. 05 MPa,搅拌转速8(Tl00转/分，培养84h。取样检测，得出每ml菌液中含有IO6以上个蛭弧菌；取样直接检测560nm下的OD值为O. 732 ;产品经保存，时间在一年以上。 实施例4
非致病性的嗜水气单胞菌的培养及噬菌蛭弧菌的培养方法同实施例2，把发酵罐的发酵体积增至I吨，经检测，每ml菌液中含有IO6以上个蛭弧菌；560nm下的OD值为O. 687 ；产品经保存，时间在一年。实施例5
假单胞菌的培养及噬菌蛭弧菌的培养方法同实施例3，把发酵罐的发酵体积增至5吨，经检测，每ml菌液中含有IO6以上个蛭弧菌；560nm下的OD值为O. 780 ;产品经保存，时间
为一年。实施例6
大肠杆菌的培养及噬菌蛭弧菌的培养方法同实施例1，把发酵罐的发酵体积增至3吨，经检测，每ml菌液中含有IO6以上个蛭弧菌；560nm下的OD值为O. 562 ;产品经保存，时间
为一年。
权利要求
1.ー种海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产エ艺，其特征在干，包括宿主菌培养和噬菌蛭弧菌培养，其中所述宿主菌培养，包括以下步骤(1) ー级摇瓶种子培养一将经活化处理后的宿主菌接种于盛装有培养基的一级摇瓶中，在温度33土TC、转速18(Γ220转/分的条件下培养18 24h，即制得一级摇瓶宿主菌种子；(2) ニ级摇瓶种子培养——在盛装有培养基的ニ级摇瓶中接入步骤(I)培养好的一级摇瓶宿主菌种子，在温度33土 1°C、转速18(Γ220转/分的条件下培养18 24h，即制得ニ级摇瓶种子；(3)种子罐培养——将步骤(2)培养好的ニ级摇瓶种子按照1°/Γ3%的体积比接入盛装有培养基的种子罐中，在罐温37土TC、罐压O. 045 O. 55 MPa、搅拌转速80 120转/分的条件下培养18 24h即制得宿主菌种子液；(4)发酵罐培养一在盛装有培养基的发酵罐中接入步骤(3)培养好的宿主菌种子液，在罐温35±1°C、罐压O. 05 MPa、搅拌转速80 100转/分的条件下培养16 24h即可；宿主菌培养过程中，在向ー级摇瓶、ニ级摇瓶、种子罐以及发酵罐的培养基接种前，盛 装有相应培养基的ー级摇瓶、ニ级摇瓶、种子罐以及发酵罐均经过灭菌处理；所述噬菌蛭弧菌培养，包括以下步骤1)将经活化处理后的噬菌蛭弧菌接种于培养好一级摇瓶宿主菌种子的一级摇瓶中，在温度33±1°C、摇瓶转速18(Γ220转/分的条件下培养18 24h，即制得ー级摇瓶噬菌蛭弧菌；2)在培养好ニ级摇瓶种子的ニ级摇瓶中，接入步骤I)培养好的ー级摇瓶噬菌蛭弧菌，在温度33土1°C、摇瓶转速18(Γ220转/分的条件下培养18 24h，即制得ニ级摇瓶噬菌蛭弧菌；3)在培养好宿主菌种子液的种子罐中，按1°/Γ5%的体积比接入步骤2)培养好的ニ级摇瓶噬菌蛭弧菌，在温度33± 1°C、罐压O. 05 MPa、搅拌转速8(Γ100转/分的条件下培养16 24h，即制得噬菌蛭弧菌种子液；4)在已培养好宿主菌的发酵罐中，按39Γ5%的体积比接入步骤3)培养好的噬菌蛭弧菌种子液，在罐温33±1°C、罐压O. 05 MPa、搅拌转速8(Tl00转/分的条件下，培养72 96h，即制得蛭弧菌菌液；一级摇瓶的培养基配方为氯化钠O. 4^0. 6 g/Ι ;酵母粉O. 2^0. 4 g/Ι ;蛋白胨或胰蛋白胨O. 4^0. 6g/l ;该培养基的pH为6. 5^6. 8 ；ニ级摇瓶的培养基配方为氯化钠O. Γ0.6 g/Ι ;酵母粉O. 2 0.4 g/Ι;蛋白胨O. 4 0. 6g/l ;该培养基的pH为6. 5 6. 8 ；种子罐的培养基配方为氯化钠O. 18^0. 22 g/Ι ;酵母粉O. 08、. 12 g/Ι ;蛋白胨或胰蛋白胨O. 18 O. 22 g/Ι ;消泡剂O. 009 O. 011 g/Ι ;该培养基的pH为7. 0 7. 2 ；发酵罐的培养基配方为氯化钠O. 18^0. 22 g/Ι ;酵母粉O. 08、. 12 g/Ι ;蛋白胨或胰蛋白胨O. 18 O. 22 g/Ι ;消泡剂O. 018 O. 022 g/Ι ;该培养基的pH为6. 5 6. 8。
2.根据权利要求I所述海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产エ艺，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌、非致病性的嗜水气单胞菌或假单胞菌。
3.根据权利要求I所述海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产エ艺，其特征在于，一级摇瓶、ニ级摇瓶、种子罐以及发酵罐的培养基所采用的PH调节试剂均为NaOH溶液。
4.根据权利要求I所述海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产エ艺，其特征在于，种子罐以及发酵罐培养基配方中所采用的消泡剂均为水溶性硅油。
5.根据权利要求I所述海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产エ艺，其特征在于，一级摇瓶、ニ级摇瓶、种子罐以及发酵罐的培养基灭菌条件为在O. lMPa、121°C的条件下历时20min。
6.根据权利要求I所述海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产エ艺，其特征在于，接入ー级摇瓶中的宿主菌以及噬菌蛭弧菌均为菌悬液；所述宿主菌菌悬液的制备方法为先采用常规方法制取斜面宿主菌，然后取斜面宿主菌I支，加入8^12ml无菌水，即可制成宿主菌菌悬液；所述噬菌蛭弧菌菌悬液的制备方法为先采用常规方法制取斜面噬菌蛭弧菌，取斜面噬菌蛭弧菌ー支，加入8^12ml无菌水，即可制成噬菌蛭弧菌菌悬液。
7.根据权利要求6所述海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产エ艺，其特征在于，一级摇瓶的培养基装量为8(Tll0ml/250ml培养瓶，而ー级摇瓶中宿主菌菌悬液接种量为O. 4^0. 6ml/瓶、噬菌蛭弧菌菌悬液接种量为l_3ml/瓶；ニ级摇瓶的培养基装量为 18(T220ml/500ml培养瓶，而ニ级摇瓶中一级摇瓶宿主菌种子、ー级摇瓶噬菌蛭弧菌的接种量均为I 3ml/瓶。
全文摘要
本发明公开了一种海水养殖专用蛭弧菌发酵生产工艺，步骤少，操作简单，利于工业化生产。所制备的噬菌蛭弧菌产品，菌体含量高，能够达到106～108个/ml，产品的保存时间长，在一年以上，易于使用。本发明的海水养殖专用蛭弧菌的发酵生产工艺特别适用于1～5吨发酵罐的生产本发明的海水养殖专用蛭弧菌发酵生产工艺适用于1～5吨发酵罐。
文档编号C12R1/01GK102776143SQ201210262349
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者尹安伟, 路怀灯, 金雪霞 申请人:江苏绿科生物技术有限公司