专利名称：一种β-葡糖苷酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于酶基因和酶工程技术领域，具体涉及一种￠-葡糖苷酶及其应用。
背景技术：
3 _匍糖昔酶(EC 3. 2. I. 21)的英文名称是@-glucosidase,又称@-D-匍糖昔水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。属于外切水解酶类，是一类在亲核分子间催化转移糖苷的酶，可以在短链的寡糖或纤维二糖 内部、在带有芳香基团或烷基的碳水化合物的残基之间打断￠-1,4-糖苷键。￠-葡糖苷酶是纤维素酶系中的一种，是纤维素降解的限速酶，在纤维素酶水解过程中将各种寡糖及纤维二糖降解为葡萄糖，是最后的关键酶，对纤维素糖化水解具有关键性作用。3 -葡糖苷酶还具有转糖苷作用，在一定的条件下可以通过转糖苷作用将两个葡萄糖分子合成一个槐糖分子。已发现槐糖是纤维素酶基因表达的强诱导物。一般认为丝状真菌中纤维素酶合成的诱导机制是存在于分生孢子和菌丝表面的少量组成性纤维素酶，首先降解纤维素生成纤维二糖等寡糖，然后在质膜结合的葡萄糖苷酶的专苷作用下，生成槐糖等诱导物，经细胞膜上的组成性透性酶系进入细胞内， 启动纤维素酶的合成。利用3-葡糖苷酶催化合成槐糖来诱导纤维素酶的生产具有巨大的商业价值和现实意义。^ -葡糖苷酶广泛存在于植物、动物和微生物。在微生物中，曲霉被普遍认为是产生葡糖苷酶的优良菌种，其中尤以黑曲霉和木霉的产量最高。但目前￠-葡糖苷酶液态发酵酶活普遍偏低；而通过固态发酵生产3-葡糖苷酶又会使成分复杂，不宜提取。故采用基因工程技术构建高产P -葡糖苷酶的工程菌株，具有重要的现实意义。纸状葡萄穗霉具有嗜纤维性，已报道的其所产纤维素酶具有较宽的pH适应性，并且对于碱性条件也有较好的耐受性。因此，从纸状葡萄穗霉中克隆新型的￠-葡糖苷酶基因，除可以研究其酶学特性以外，还可为研究糖苷水解酶家族特征及酶的体外定向改造提供理论上的指导。
发明内容
本发明的目的是提供一种P -葡糖苷酶及其应用，即一种具有工业应用价值的新型@ -葡糖苷酶，从而弥补现有技术的不足。本发明获得的￠-葡糖苷酶的基因，包含有2508bp的DNA，编码一个由817个氨基酸组成的蛋白质。本发明的P -葡糖苷酶，包括有a)序列为 SEQ ID NO 1 的酶；b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。编码上述0 -葡糖苷酶的核苷酸，其序列为SEQ ID NO :2。本发明还提供用于表达上述￠-葡糖苷酶的重组表达质粒，是将序列为SEQ IDNO 2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。所述的原核表达载体为pGm。本发明还涉及携带有表达上述木糖苷酶的重组表达质粒的重组菌。本发明的葡糖苷酶用于燃料乙醇等能源物质的生产、食品工业中的风味酶、饲料的生产等。本发明提供的β_葡萄糖苷酶，发酵进行到第5天时，发酵液酶量达到最大值5313. 82U/ml ;其最适温度为50°C，最适pH为5. 8。并且该酶还具有很高的木糖苷酶活性，为58. 20U/ml。另外，本发明的β _葡萄糖苷酶还具有脱氧葡萄糖和潮霉素抗性以及转糖苷作用。在转糖苷作用下，可以使纤维二糖等寡糖生成槐糖等诱导物，再经细胞膜上的组成性 透性酶系统进入细胞内，启动细胞内纤维素酶的合成。故而可以利用葡萄糖苷酶催化合成槐糖来诱导纤维素酶的生产，更具有巨大的商业价值。
图I :本发明的β -葡糖苷酶基因DNA电泳图谱；图2 :本发明的质粒pGm_gl0158的构建图；图3 :本发明的葡糖苷酶在不同温度下的相对活力；图4 :本发明的葡糖苷酶在不同pH值下的相对活力；图5 :本发明的葡糖苷酶在不同温度下的热稳定性。
具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。一、β -葡糖苷酶的筛选及检测I、纸状葡萄穗霉菌(购自中国微生物菌种保管委员会普通微生物中，CGMCC
3.5365)总 DNA 提取(I)将纸状葡萄穗霉菌用CMC液体培养基，在30°C、200rpm条件下摇床培养48小时；(2)用无菌纱布过滤得菌丝体，将菌丝体在液氮中磨成粉末。(3)提取方法参考试剂盒(Fungal DNA kit)。2、β -葡糖苷酶基因的扩增根据纸状葡萄穗霉菌全基因组分析得到的β -葡糖苷酶基因序列即SEQ NO. I所示的核苷酸序列，设计一对寡核苷酸引物Pl和Ρ2，其序列为PI:5' -CCATTACGTAAGAATGCGGACCTCACTGTCAGTCG-3'P2:5/ -CTAGTCTAGACTAAGCCTGCACGGGCTGAT-3'以实施例I提取的基因组DNA为模版，扩增葡糖苷酶基因。反应程序如下第一阶段变性95°C，3min ;第二阶段变性94°C，30s，退火58°C，30s,延伸68°C 3min,共进行25个循环；第三阶段延伸72°C，10min。得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图I。3、表达载体的构建用SnaBl和Xbal双酶切实施例2得到的PCR扩增产物和pGm质粒(具有乙酰胺和氨苄选择标记)，胶回收后，然后用T4连接酶将酶切后的gl0158与pGm质粒置于16°C过夜连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌DH5 a (Trans5 a Chemically CompetentCell，北京全式金生物技术有限公司)感受太细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有β_葡糖苷酶基因(gl0158)的重组质粒。测序结果表明筛选出的葡糖苷酶的核苷酸序列为SEQ ID NO :2，翻译出的氨基酸序列为SEQ ID NO :2。4、转化黑曲霉及重组子筛选坚定(I)将黑曲霉Gl孢子用CMC液体培养基，30°C培养过夜。(2)将(I)中获得的菌体用6层无菌纱布过滤，并用SolutionA冲洗(3)将(2)中获得的菌丝体放入加有 O. 6g Lysing Enzymes 和 40ml Solution B的无菌三角瓶中，混勻，30°C, 150rpm, I小时后，将转速改为80rpm, I小时。(4)然后用两层无菌神奇滤布过滤，将滤液分装到50ml无菌离心管中，加 Solution B 至 45ml, 4000rpm,离心 lOmin。弃上清；加 20ml Solution B 混勻，4000rpm,离心5min,弃上清；再加20ml Solution B混勻，4000rpm,离心5min,弃上清。(5)加IOOul Solution B混勻，加IOul实施例3得到的重组质粒；再加12. 5ulSolution C混匀，冰上静置20min。(6)加 2ml Solution B, Iml Solution C 和 8ml adms 上层培养基，混勻，倒入 3 个adms下层培养基平板中，30°C恒温箱培养。3_4天后，观察有无转化子长出。(7)将长出的转化子转接adms 二次验证培养基平板中，30°C恒温箱培养，并进行菌落PCR验证，获得阳性菌株。5、重组菌株的培养和β-葡糖苷酶的表达将获得的阳性菌株接种于Promosoy Special medium液体培养基中，于30 0C 200rpm摇床培养。二、β -葡糖苷酶的活性测定以对-硝基苯酚-β -D-葡萄糖苷(pNPG)为底物测定β -葡萄糖苷酶的活性，以每分钟催化pNPG生成I微摩尔对-硝基苯酹(p-nitrophenol)所需的酶量为一个酶活单位(IU)。I、β -葡糖苷酶最适反应温度、pH和热稳定性测定I).测定本发明葡糖苷酶在不同温度下的比活力反应体系为在IOOul缓冲液中加适当稀释浓度的粗酶液50ul再加入5mMpNPG50ul。混匀，分别置于30-80°C水浴中，准确计时15min ;反应结束后，迅速、准确地加入IM碳酸钠溶液100ul，摇匀，然后在410nm下测定吸光值。测定结果参见图3。从该图中可以看出，木糖苷酶的最适反应温度为50°C2、测定本发明葡糖苷酶在不同pH下的比活力反应体系与测定本发明葡糖苷酶在不同温度下的比活力相同，缓冲液的pH分别为2.4-7.8，反应温度为501。测定结果参见图4。从该图中可以看出，葡糖苷酶的最适反应pH为4. 83、测定本发明葡糖苷酶的热稳定性将一定浓度的粗酶液放入40、50和60°C水浴中温浴，每隔一小时取出一部分酶做
酶活反应。
反应体系为在IOOul缓冲液中加适当稀释浓度的粗酶液50ul再加入5mMpNPG 50ul。混匀，置于50°C水浴中，准确计时15min ;反应结束后，迅速、准确地加入IM碳酸钠溶液IOOul,摇勻,然后在410nm下测定吸光值。测定结果参见图5。三、@ -葡糖苷酶的应用在50ml的锥形瓶中加入30ml,400mg/ml的葡萄糖溶液、3ml本发明的P -葡萄糖苷酶的粗酶液，在50°C、pH 4. 5下反应100h，加热终止反应，所制备成的复合糖液即可用于
诱导纤维素酶生产。在250ml锥形瓶中装液50ml，接种10%，在30°C，180r/min下培养，测定发酵液中的滤纸酶活力和还原糖含量。结果显示在利用葡萄糖苷酶制备的复合物为碳源的情况下的产酶结果与以葡萄糖为碳源的对照相比，纤维素酶活力提高了 20倍，显示了良好的工 业应用前景。
权利要求
1.ー种β-葡糖苷酶，其特征在于，所述的β-葡糖苷酶包括有 a)序列为SEQID NO 1的酶； b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加ー个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
2.一种核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸用于编码权利要求I所述的葡糖苷酶。
3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列为SEQID Ν0:2。
4.一种用于表达权利要求I所述的葡糖苷酶的重组表达质粒，其特征在于，所述的重组表达质粒是将序列为SEQ ID NO 2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。
5.如权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于所述的原核表达载体为pGm。
6.ー种重组菌，其特征在于，所述的重组菌携带有权利要求4所述的重组表达质粒。
7.权利要求I所述的β-葡糖苷酶在能源物质生产、风味酶和饲料生产中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种β-葡糖苷酶及其应用，包括有a)序列为SEQ ID NO1的酶；b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。本发明提供的β-葡萄糖苷酶具有脱氧葡萄糖和潮霉素抗性还具有转糖苷作用，在转糖苷作用下，可以使纤维二糖等寡糖生成槐糖等诱导物，再经细胞膜上的组成性透性酶系统进入细胞内，启动细胞内纤维素酶的合成。故而可以利用β-葡萄糖苷酶催化合成槐糖来诱导纤维素酶的生产，更具有巨大的商业价值。
文档编号C12N1/15GK102827820SQ20121028171
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者王华明, 于海玲 申请人:天津工业生物技术研究所