专利名称：一种植物抗旱基因的制作方法
技术领域：
本发明是空心莲子草的一种抗旱基因，属于基因工程技术领域。
背景技术：
目前，应用转基因技术提高植物的抗旱性已经成为共识，但已分离的植物抗旱基因种类及数量还很有限，且多是从对干旱敏感植物中克隆获得。空心莲子草抗旱能力很强，其体内应该有一系列抗旱能力强的基因，是进行抗旱基因研究的良好材料。由于水稻和空心莲子草均可正常生长于淡水环境中，与来自于干旱敏感植物及陆生植物的耐旱基因相比，将来自空心莲子草的抗旱基因转入水稻可能会更有效。因此分离空心莲子草的抗旱基因，为应用基因工程技术提高植物尤其是水稻抗旱性，提供了更加丰富的优良候选基因。
发明内容
本发明克隆了空心莲子草的一种抗旱基因ApCL。该基因长度为734bp，开放阅读框从核苷酸第22-522位，编码166个氨基酸。
具体实施例方式采用砂培法通过浇灌Hoagland营养液在室内培养空心莲子草，白天30°C晚上25°C，空气相对湿度70%，光照12h，光强是^Oumol/mVs1。当空心莲子草的茎节上长出约Icm长的须根时，停止浇水3天，剪取须根。按照INVITROGEN Trizol说明书提取须根RNA，再按照TAKARA DNaseI说明书去除 RNA 中残存的 DNA。用 5 u g 总 RNA 按照 Promega 公司的 M-MLV Reverse Transcriptase说明书进行逆转录得到cDNA。设计上游引物5 ' -GATCAAGTCCCCCACCTA-3 '和下游引物5 ' -CGGCAATGATTCAAATATATT-3 '进行抗旱基因ApCL的PCR扩增。PCR反应体系如下5ul 10Xbuffer, 4ul dNTP (2. 5mmol L-1), Iul 上游引物(10 u mol. L1), Iul 下游引物(IOumol L1)，0. 25ul(5U uF^Taq 酶，2ulcDNA，补充无菌 ddH20 至 50ul。PCR 反应条件如下，94°C预变性 lmin，94°C 30sec，54°C 30sec，72°C lmin，35 个循环，72°C IOmin0 在对PCR产物进行胶回收纯化后，连接T载体转化测序。通过半定量PCR技术检测抗旱基因ApCL在干旱后表达情况。植物材料培养同上，只是材料分为两部分，分别用于对照和干旱处理。为了消除cDNA浓度的影响，选用看家基因Actin作为内参对照。Actin的扩增方法是以干旱处理前后的cDNA为模板，用上游引物 5 ' -TGAACTTCGTGTTGCTCCAGA-3 '和下游引物 5 ' -AACCCTCGTAGATTGGCACAG-3 '进行 PCR 扩增。PCR 反应体系如下5ullOXbuffer,4ul dNTP(2. 5mmol L1)，Iul 上游引物(IOumol L1), Iul 下游引物(IOumol L1)，0. 25ul (5U ul^Taq 酶，2ulcDNA，补充无菌 ddH20 至 50ul。PCR 反应程序94 °C 3min ；94 °C 20sec，55°C 20sec，72°C20sec，72°C lOmin，扩增产物大小为230bp。再根据本发明公开的抗旱基因ApCL核苷酸序列(SEQ ID NO. I)，设计上游引物5 ' -TCGCCCTCATCCCACCAT-3 '和下游引物5' -GCAGTCACCTGGGTTCTTCG-3'，以干旱处理前后的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系如下5ullOXbuffer, 4ul dNTP (2. 5mmol LI)，Iul 上游引物(10 u mo I L1)，Iul 下游引物(IOumol L-1), 0. 25ul(5U .urOTaq 酶，2ulcDNA，补充无菌 ddH20 至 50ul。PCR 反应程序94°C 3min,94°C 10sec，59°C 10sec，72°C 10sec，72°C lOmin。扩增产物大小为102bp。为使PCR扩增在指数期进行，Actin和上述抗旱基因均进行25，30，35，40个循环的扩增。对指数扩增期PCR产物进行电泳，而后用凝胶成像系统观察分析干旱处理前后Actin和上述抗旱基因ApCL的PCR产物条带亮度。
通过斑点杂交技术检测其在干旱前后表达量。为了消除cDNA浓度的影响，选用看家基因Actin作为内参对照，Actin的扩增方法同上。吸取Iul的Actin和ApCL的PCR产物分别点在两张尼龙膜上，对干旱处理前后cDNA进行地高辛标记做为探针，用探针对尼龙膜上的Actin和ApCL进行杂交，研究抗旱基因ApCL在干旱处理前后的表达情况。将得到的抗旱基因ApCL序列提交Genbank，经Blast比对表明，该基因与腐霉菌分泌蛋白基因同源性高达95%，与其他物种没有同源性。此类基因功能未见报道。我们的上述试验证明该基因在干旱胁迫后表达量增加，是一种新的抗旱基因。该基因的克隆扩大了植物抗旱研究的基因资源，为运用基因工程技术提高植物尤其是水稻抗旱性，提供了更加丰富的优良候选基因。图I,半定量PCR显示抗旱基因ApCL在干旱不同时间表达量图2,斑点杂交显示抗旱基因ApCL在干旱处理前(A)、后(B)表达量。
权利要求
1.一种植物抗旱基因，其碱基序列如SEQ ID NO. I所示。
全文摘要
本发明涉及一种植物抗旱基因序列，属于基因工程技术领域。其特征在于该基因长度为734bp，开放阅读框从核苷酸第22-522位，编码166个氨基酸。应用半定量PCR技术和斑点杂交技术，研究该基因在干旱胁迫后的表达，发现干旱胁迫后该基因表达量增加，为植物抗旱基因。该基因的克隆扩大了植物抗旱研究的基因资源，为运用基因工程技术提高植物尤其是水稻抗旱性，提供了更加丰富的优良候选基因。
文档编号C12N15/29GK102776205SQ20121028949
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者习金根, 何光源, 刘巧莲, 尹亮, 张世清, 易克贤, 杨峰, 杨辉, 罗才波, 肖强, 郑金龙, 陈河龙, 高建明 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所