专利名称：一种从百合组织中同时提取dna和rna的方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及从百合组织中同时提取DNA和RNA的方法，尤其是从百合鳞片中同时提取DNA和RNA的方法。
背景技术：
提取较高质量的DNA和RNA是分子生物学实验研究的一项最基本工作，使用一种简便、高效的核酸提取方法对提高实验效率很有必要。目前，植物组织DNA的提取方法主要有CTAB法、SDS法、高盐低渗法等，RNA提取的主要方法有异硫氰酸胍-酚-氯仿法(一步法)、CTAB法、SDS法和热硼酸法等。这些提取方法的步骤基本相似，首先充分破碎植物细胞的细胞壁，接着使核蛋白复合体中的蛋白充分变性，实现核蛋白与核酸的分离；同时抑制内源和外源核酸酶的活性，防止核酸污染被降解，然后将DNA和RNA与多糖、多酚等杂质分离，得到纯净的DNA或RNA，最后进行质量检测。目前，常规的核酸提取方法或使用的试剂盒大都是针对单独的DNA或RNA进行提取，较少有用一种方法同时提取植物组织中的DNA和RNA。百合等植物中富含大量的多糖类物质和酚类化合物，同时还含有较多的成分确定或不确定的次生代谢物。酚类化合物在匀浆和提取过程中极易被氧化成醌类物质，与核酸发生不可逆结合，严重影响核酸的分离纯化。多糖的许多理化性质与核酸相似，在提取过程中与核酸共沉淀，很难将它们分尚。在植物生长发育过程中，包括DNase和RNase在内的各种水解酶大量积累，同时各种次生代谢物质大量积累，给植物组织中核酸的提取带来极大的困难。近年来，有关从富含多糖多酚及次生代谢物质的植物组织中提取DNA或RNA的方法已有较多报道。葛晓萍等利用CTAB-LiCl法从苹果和草莓的一些组织中提取到总RNA (一种适合多糖、多酚植物的RNA提取方法。青岛科技大学学报，2007，28 :6-8)。郭书巧等也利用CTAB-LiCl法从甜叶菊中成功的分离了甜叶菊的总RNA (甜叶菊RNA分离方法研究。基因组学与应用生物学，2009，28 :101-104)。贾晋等确定了 SDS法为提取盐爪爪核酸的最佳方法，同时增加了 LiCl和无水乙醇特异沉淀步骤，用于RNA的提取(盐爪爪核酸提取方法研究。中国农学通报，2010，26:49-52)。陈肃等通过无水乙醇对植物材料的预处理，用CTAB-LiCl-无水乙醇法从一些木本植物组织中得到了质量合格的RNA (—种快捷有效的提取树木RNA方法。辽宁林业科技，2008，05:25-27)。尹慧等采用改进了的CTAB从百合叶片中成功的提取了总RNA (百合叶片总RNA提取方法比较及优化。中国农业大学学报，2008，13:41-45)。杜中军等采用改进的SDS法，结合使用无水乙醇和醋酸钾除去多糖，从富含多糖的芒果组织中提取到完整的总RNA (—种改进的富含多糖的芒果组织中完整总RNA的提取方法。植物生理学通讯，2005, 41:202-204)。杨秀梅等采用CTAB法提取百合鳞片基因组DNA，用去多糖缓冲液除去多糖，得到了高质量的基因组DNA (百合鳞片DNA的提取及RGA-PCR体系的优化。西南农业学报，2011，24:266-269)。侯思名等利用加入了抗氧化剂和高盐溶液的CTAB法成功提取了苎麻组织的DNA (苎麻总DNA提取的CTAB法优化方案。西北植物学报，2005，25:2193-2197)。占亚光等采用改良的CTAB法从白桦成熟叶片中提取了质量较好的DNA (富含多糖的白桦成熟叶片DNA的提取方法。东北林业大学学报，2005，33:24-25)。对于同时从一种植物组织中提取DNA和RNA的方法，一些文献也有所报道。黄真池等利用钙盐分级沉淀法从尾叶桉叶片中得到了完整的DNA和RNA (—种木本植物RNA和DNA的简捷提取方法。湖北农业科学，2010，49:773-774)。魏利斌等采用CTAB法同步提取了芝麻中的DNA和RNA (芝麻DNA和RNA同步提取方法。分子植物育种，2008，06:1025-1030)。刘胜洪等利用高盐低pH的缓冲液提取核酸，再用LiCl选择性沉淀RNA,从猕猴桃组织中分离得到了 DNA和RNA (—种高效提取猕猴桃DNA和RNA的方法。生物技术通报，2011，09:171-175)。王伶平等利用CTAB法提取山药总核酸，然后总核酸溶液一分为二，一份用于分离RNA，另一份用于分离DNA (—种同时提取植物DNA和RNA的方法。CN101486747B)。许多植物组织中富含多糖、多酚及次生代谢物质，使得核酸提取困难。目前，对这些植物组织核酸的提取一般只针对单一的DNA或RNA，很少采用一种方法同时提取DNA和RNA。当植物组织有限或较稀少时，单一的提取DNA或RNA很难满足实验的需要。百合组织 中富含多糖多酚及次生代谢物质，特别是百合鳞片中多糖含量极高，给百合组织核酸的提取带来极大的困难。现有的同步提取植物DNA和RNA的方法存在耗时长、操作复杂、分离效率低等不足，而且对于百合组织DNA和RNA的提取效果并不好。因此，发展一种应用广、耗时少、操作简便的同步提取百合组织中DNA和RNA的方法十分必要。
发明内容
本发明提供了一种从百合组织中同时提取DNA和RNA的方法，尤其是从多糖含量很高的百合鳞片中同时提取DNA和RNA的方法。本发明共分为三步，第一步利用异硫氰酸胍法结合高浓度醋酸钾去除多糖得到总核酸粗提沉淀；第二步采用DEPC处理过的ddH20溶解核酸沉淀，并用碱性的Tris平衡酚和氯仿纯化总核酸，得到总核酸溶液；第三步利用氯化锂和无水乙醇选择性沉淀RNA，之后用醋酸钠以及异丙醇沉淀DNA，最终依次获得了 RNA和DNA。本发明包括以下具体步骤
(1)取0.5-lg百合植物组织，加入液氮研磨成粉末，按每克组织材料添加12-15ml的异硫氰酸胍提取缓冲液的比例加入预冷的异硫氰酸胍提取液，充分震荡混匀，冰浴10_15min，再加入提取液1/10体积3mol L—1醋酸钠(pH4. 5-5. 5)，颠倒混匀；其中异硫氰酸胍提取缓冲液成分为4. 5mol L—1异硫氰酸胍，25mmol L—1朽1檬酸钠,0. 5% (w/v)十二烧基肌氨酸钠，3% (w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取缓冲液加入ImL ^ -巯基乙醇；
(2)在步骤(I)得到的混合液中加入与提取液等体积的氯仿，剧烈震荡混匀，冰上放置5min后于4°C 12000g离心IOmin,取上清置于新的离心管中，重复此步骤一次；
(3)向步骤(2)中得到的上清液中加入1/3提取液体积的8molL—1醋酸钾(pH4. 5-5. 5，预冷)，颠倒混匀，冰上放置lOmin，4°C 12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中，重复此步骤一次；
(4)向步骤(3)得到的上清液中加入与提取液等体积的异丙醇，混匀后-20°C放置30min,接着4°C 12000g离心lOmin,得到核酸粗提沉淀物；(5)用75%的乙醇清洗沉淀两次，室温下干燥20min，用0.5-lmL DEPC处理过的ddH20彻底溶解沉淀；
(6)在步骤(5)得到的总核酸溶液中加入0.5-lmLTris饱和酚/氯仿混合液，Tris饱和酚/氯仿混合液中Tris饱和酚与氯仿的体积比为1:1，剧烈震荡混匀，冰上放置5min，于40C 12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中；
(7)向步骤(6)的上清液中加入0.5-lmL氯仿，剧烈震荡混匀，冰上放置5min，4°C12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中；
(8)向步骤(7)的上清液中加入0.125-0. 25mL IOmol L—1氯化锂，混匀后加入
0.25-0. 5mL无水乙醇，上下颠倒混匀后_20°C放置2h沉淀RNA，4°C 14000g离心15min，取上清液置于新的离心管中；
(9)用75%的乙醇清洗步骤(8)得到的RNA沉淀两次，室温下干燥lOmin，用60-100y L DEPC处理过的ddH20溶解RNA沉淀，_80°C保存备用；
(10)向步骤(8)得到的上清液中加入0.875-1.75mL异丙醇和0.0875-0. 175mL 3molL-1醋酸钠(pH4. 5-5. 5)，混匀后-20°C放置30min沉淀DNA,室温下12000g离心15min，得到DNA沉淀，用75%乙醇清洗两次，在室温下干燥lOmin，用60-100 u L TE缓冲液溶解，于-20°C保存备用。所用的植物材料为眠江百合{Lilium regale)的幼嫩鳞片、东方百合{LiIium"Oriental Hybrids")西伯利亚百合的幼嫩叶片、通江百合、Lilium sargentiae)的幼嫩根。本发明在传统的异硫氰酸胍法提取RNA的基础上，针对百合组织中富含多糖多酚及次生代谢物质的特点，特别是多糖含量极高的特点，做了以下改进
在细胞裂解后，不直接用酚抽提，而是采取氯仿抽提两次，能有效的去除次生代谢物质。在异丙醇沉淀粗提核酸沉淀之前，两次利用高浓度醋酸钾沉淀多糖，能将有效去除溶液中的多糖。在沉淀RNA这一步,利用氯化锂和无水乙醇协同选择性沉淀RNA,使沉淀RNA的时间大大缩短，且RNA沉淀充分，接着利用异丙醇和醋酸钠沉淀DNA，实验结果表明本发明所得到的RNA没有DNA的污染，同时提取的DNA中也没有RNA的残留。本发明操作简便，耗时较短，全部过程可在7小时内完成，较好的解决了从富含多糖多酚及次生代谢物质百合组织提取DNA和RNA过程中多糖和次生代谢物质干扰的问题，且可以同时得到高质量的DNA和RNA，为后续的分子生物学实验奠定了很好的基础。
图I为本发明中从岷江百合鳞片中同时提取基因组DNA和总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道I为岷江百合鳞片基因组DNA ;泳道2为岷江百合鳞片总RNA。图2为本发明中从西伯利亚百合叶片中同时提取的基因组DNA和总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道I为西伯利亚百合叶片基因组DNA ;泳道2为西伯利亚百合叶片总RNA。图3为本发明中从通江百合根中同时提取的基因组DNA和总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道I为通江百合根基因组DNA ;泳道2为通江百合根总RNA。图4为本发明中岷江百合鳞片基因组DNA酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中Marker 为分子量标准(DL2000 DNA Marker,由 2，OOObpU, 000bp、750bp、500bp、250bp 以及IOObp六条DNA片段组成);泳道I为岷江百合鳞片基因组DNA ;泳道2为岷江百合鳞片基因组DNA的&oRI酶切产物；泳道3为岷江百合鳞片基因组DNA的汉^sHI酶切产物。图5为本发明中西伯利亚百合叶片基因组DNA酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中Marker为分子量标准(DL2000 DNA Marker);泳道I为西伯利亚百合叶片基因组DNA ；泳道2为西伯利亚百合叶片基因组DNA的及 oRI酶切产物；泳道3为西伯利亚百合叶片基因组DNA的酶切产物。图6为本发明中通江百合根基因组DNA酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中Marker为分子量标准(DL2000 DNA Marker);泳道I为通江百合根基因组DNA ;泳道2为通 江百合根基因组DNA的&0RI酶切产物；泳道3为通江百合根基因组DNA的及酶切产物。图7为本发明中岷江百合鳞片、西伯利亚百合叶片、通江百合根总RNA用于扩增3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的RT-PCR分析结果；其中Marker为分子量标准(DL2000 DNA Marker);泳道I为空白对照(ddH20为模板)；泳道2为岷江百合鳞片总RNA的RT-PCR产物；泳道3为西伯利亚百合叶片总RNA的RT-PCR产物；泳道4为通江百合根总RNA 的 RT-PCR 产物。图8为本发明中岷江百合鳞片、西伯利亚百合叶片、通江百合根总RNA用于扩增肌动蛋白基因(Kifl)的RT-PCR分析结果；其中Marker为分子量标准(DL2000 DNAMarker);泳道I为空白对照(ddH20为模板);泳道2为岷江百合鳞片总RNA的RT-PCR产物；泳道3为西伯利亚百合叶片总RNA的RT-PCR产物；泳道4为通江百合根总RNA的RT-PCR产物。
具体实施例方式下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例I :从岷江百合鳞片中同时提取RNA和DNA的方法，具体操作如下
(1)取液氮速冻的野生岷江百合幼嫩鳞片0.Sg，用液氮研磨成粉末，将样品粉末迅速转移到离心管中，加入12mL预冷的异硫氰酸胍提取缓冲液，充分震荡混匀置于冰上12min，再加入1.2mL 3mol L—1醋酸钠(pH5. 0)，颠倒混匀；其中异硫氰酸胍提取缓冲液成分为4. 5mol I71异硫氰酸胍，25mmol I/1朽1檬酸钠,0. 5% (w/v)十二烧基肌氨酸钠,3% (w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取缓冲液加入ImL ^ -巯基乙醇；
(2)在步骤(I)得到的样品混合液中加入12mL氯仿，剧烈震荡混匀，冰上放置5min后于4°C 12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中，重复此步骤一次；
(3)向步骤(2)中得到的上清液中加入4mL8mol L—1醋酸钾(pH5. 0,预冷)，颠倒混匀,冰上放置10min，4°C 12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中，重复此步骤一次；
(4)向步骤(3)得到的上清液中加入12mL异丙醇，混匀后_20°C放置30min，接着4°C12000g离心lOmin,得到核酸粗提沉淀物；(5)用75%的乙醇清洗沉淀两次，室温下干燥20min，用0.8mL DEPC处理过的ddH20彻底溶解沉淀；
(6)在步骤(5)得到的总核酸溶液中加入0.8mL Tris饱和酹/氯仿混合液，Tris饱和酚/氯仿混合液中Tris饱和酚与氯仿的体积比为1: 1，剧烈震荡混匀，冰上放置5min，于40C 12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中；
(7)向步骤(6)的上清液中加入0.8mL氯仿，剧烈震荡混匀，冰上放置5min，4°C12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中；
(8)向步骤(7)的上清液中加入0.2mLIOmol L—1氯化锂，混匀后加入0. 4mL无水乙醇，上下颠倒混匀后_20°C放置2h沉淀RNA，40C 14000g离 心15min，取上清液置于新的离心管中；
(9)用75%的乙醇清洗步骤(8)得到的RNA沉淀两次，室温下干燥lOmin，用80ii LDEPC处理过的ddH20溶解RNA沉淀，_80°C保存备用；
(10)向步骤(8)得到的上清液中加入1.4mL异丙醇和0.14mL 3mol L—1醋酸钠(pH5. 0)，混匀后-20°C放置30min沉淀DNA，室温下12000g离心15min，得到DNA沉淀，用75%乙醇清洗两次，在室温下干燥lOmin，用80 y L TE缓冲液溶解，于_20°C保存备用。应用本发明的方法，从0. 8g野生岷江百合鳞片中提取了总RNA 63呢，总DNA76Pg，RNA和DNA的得率分别为78. 75Pg/g和95Pg/g。核酸质量检测经琼脂糖凝胶电泳结果(见图I)表明从岷江百合鳞片中提取的DNA、RNA完整性好。在紫外分光光度计上测定260nm和280nm吸光度比值A260ZA280分别为I. 76和I. 95，而DNA和RNA纯品的A26(l/A28(l分别为I. 8和2. O，可见利用本发明的方法从岷江百合鳞片中同时提取的RNA和DNA纯度很高，完全满足分子生物学实验的要求。
实施例2 :从西伯利亚百合叶片中同时提取RNA和DNA的方法，具体操作如下
(1)取液氮速冻的东方百合品种西伯利亚幼嫩叶片lg，用液氮研磨成粉末，将样品粉末迅速转移到离心管中，加入12mL预冷的异硫氰酸胍提取缓冲液，充分震荡混匀置于冰上15min,再加入I. 2mL 3mol L—1醋酸钠(pH4. 5),颠倒混勻；其中异硫氰酸胍提取缓冲液成分为4. 5mol I71异硫氰酸胍，25mmol I/1朽1檬酸钠,0. 5% (w/v)十二烧基肌氨酸钠,3% (w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取缓冲液加入ImL ^ -巯基乙醇；
(2)在步骤(I)得到的样品混合液中加入12mL氯仿，剧烈震荡混匀，冰上放置5min后于4°C 12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中，重复此步骤一次；
(3)向步骤(2)中得到的上清液中加入4mL8mol L—1醋酸钾(pH4. 5,预冷)，颠倒混匀,冰上放置10min，4°C 12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中，重复此步骤一次；
(4)向步骤(3)得到的上清液中加入12mL异丙醇，混匀后_20°C放置30min，接着4°C12000g离心lOmin,得到核酸粗提沉淀物；
(5)用75%的乙醇清洗沉淀两次，室温下干燥20min，用ImLDEPC处理过的ddH20彻底溶解沉淀；
(6)在步骤(5)得到的总核酸溶液中加入ImLTris饱和酹/氯仿混合液,Tris饱和酹/氯仿混合液中Tris饱和酚与氯仿的体积比为1:1，剧烈震荡混匀，冰上放置5min，于4°C12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中；(7)向步骤(6)的上清液中加入ImL氯仿，剧烈震荡混匀，冰上放置5min，4°C12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中；
(8)向步骤(7)的上清液中加入0.25mLIOmol L—1氯化锂，混匀后加入0. 5mL无水乙醇，上下颠倒混匀后_20°C放置2h沉淀RNA，40C 14000g离心15min，取上清液置于新的离心管中；
(9)用75%的乙醇清洗步骤(8)得到的RNA沉淀两次，室温下干燥lOmin，用100y LDEPC处理过的ddH20溶解RNA沉淀，_80°C保存备用；
(10)向步骤(8)得到的上清液中加入1.75mL异丙醇和0.175mL 3mol L—1醋酸钠(pH4. 5)，混匀后-20°C放置30min沉淀DNA，室温下12000g离心15min，得到DNA沉淀，用75%乙醇清洗两次，在室温下干燥lOmin，用100 y L TE缓冲液溶解，于_20°C保存备用。应用本发明所述的方法，从Ig西伯利亚百合叶片中同时提取获得了 102呢总RNA，135吒总DNA ；RNA和DNA的得率分别为102l^g/g和135Pg/g。 质量检测经琼脂糖凝胶电泳结果(见图2)表明本发明提取的西伯利亚叶片的RNA、DNA完整性很好，在紫外分光光度计上测定260nm和280nm吸光度比值A260ZA280分别为
I.77和I. 96，而DNA和RNA纯品的A26(l/A28(l分别为I. 8和2. O，可见利用本发明的方法从西伯利亚百合叶片中同时提取的RNA和DNA纯度很高，完全满足分子生物学实验的要求。实施例3 :从通江百合根中同时提取RNA和DNA的方法，具体操作如下
(1)取液氮速冻的通江百合幼嫩根0.5g，用液氮研磨成粉末，将样品粉末迅速转移到离心管中，加入6. 5mL预冷的异硫氰酸胍提取液，充分震荡混匀置于冰上lOmin，再加入0. 65mL 3mol L—1醋酸钠(pH5. 5)，颠倒混匀；其中异硫氰酸胍提取缓冲液成分为4. 5molL—1异硫氰酸胍，25mmol L—1柠檬酸钠，0. 5% (w/v)十二烷基肌氨酸钠，3% (w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取缓冲液加入ImL ^ -巯基乙醇；
(2)在步骤(I)得到的样品混合液中加入6.5 mL氯仿，剧烈震荡混匀，冰上放置5min后于4°C 12000g离心lOmin,取上清置于新的离心管中，重复此步骤一次；
(3)向步骤(2)中得到的上清液中加入2.17mL 8mol L—1醋酸钾(pH5. 5，预冷)，颠倒混匀，冰上放置10min，4°C 12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中，重复此步骤一次；
(4)向步骤(3)得到的上清液中加入6.5mL异丙醇，混匀后_20°C放置30min，接着4°C12000g离心lOmin,得到核酸粗提沉淀物；
(5)用75%的乙醇清洗沉淀两次，室温下干燥20min，用0.5mL DEPC处理过的ddH20彻底溶解沉淀；
(6)在步骤(5)得到的总核酸溶液中加入0.5mL Tris饱和酚/氯仿混合液，Tris饱和酚/氯仿混合液中Tris饱和酚与氯仿的体积比为1: 1，剧烈震荡混匀，冰上放置5min，于40C 12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中；
(7)向步骤(6)的上清液中加入0.5mL氯仿，剧烈震荡混匀，冰上放置5min，4°C12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中；
(8)向步骤(7)的上清液中加入0.125mL IOmol L^1氯化锂，混匀后加入0. 25mL无水乙醇，上下颠倒混匀后_20°C放置2h沉淀RNA，40C 14000g离心15min，取上清液置于新的离心管中；(9)用75%的乙醇清洗步骤(8)得到的RNA沉淀两次，室温下干燥lOmin，用60ii LDEPC处理过的ddH20溶解RNA沉淀，_80°C保存备用；
(10)向步骤(8)得到的上清液中加入0.875mL异丙醇和0.0875mL3mol L—1醋酸钠(pH5. 5)，混匀后-20°C放置30min沉淀DNA，室温下12000g离心15min，得到DNA沉淀，用75%乙醇清洗两次，在室温下干燥lOmin，用60 y L TE缓冲液溶解，于_20°C保存备用。应用本发明的方法，从0. 5g通江百合根中同时提取了总RNA 53呢，总DNA67Pg，RNA和DNA的得率分别为106Pg/g和134Pg/g。质量检测琼脂糖凝胶电泳结果(见图3)表明从通江百合根中同时提取的RNA、DNA完整性很好，在紫外分光光度计上测定260nm和280nm吸光度比值A26(l/A28(l分别为I. 76和I. 97，而DNA和RNA纯品的A26(l/A28(l分别为I. 8和2. O，可见利用本发明的方法从通江百合根中同时提取的RNA和DNA纯度很高，完全满足分子生物学实验的要求。实施例4 :从岷江百合鳞片、西伯利亚百合叶片以及通江百合根中提取基因组DNA 的酶切检测
对上述实施例中应用本发明的方法分别提取的岷江百合鳞片、西伯利亚百合叶片以及通江百合根基因组DNA进行限制性内切酶处理，进一步检验所提取DNA的质量。酶切反应体系为基因组DNA 4吒；限制性内切酶15U (.EcoRl或汉); 10XTango Buffer 2ML ;补充ddH20至终体积为20ML。酶切反应时间为12h，酶切结束后取8ML用于琼脂糖凝胶电泳，结果分别如附图4、5、6所示。表明本发明从岷江百合鳞片、西伯利亚百合叶片以及通江百合根中提取基因组DNA均能被&0RI或完全酶切，可见所提取的DNA质量高，能满足分子生物学实验所需。实施例5 :从岷江百合鳞片、西伯利亚百合叶片以及通江百合根中提取总RNA的RT-PCR分析
根据上述实施例中测定的RNA浓度，分别将岷江百合鳞片、西伯利亚叶片以及通江百合根总RNA样品稀释至0. 5Pg/ML。采用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒将RNA逆转录成第一链cDNA，反应体系和操作过程如下分别取总RNA 5u g,加入oligo (dT) 2 u L,加入DEPC处理过的ddH20定容至14 u L0混匀后，70°C加热变性5 min后迅速在冰上冷却
2min,然后加入下列成分5XFirst_stand buffer 4 u L> dNTP (IOmM each) 0. 5 u L>RNasin (40U) 0. 5 u L, M-MLV (200U) I u L0 混匀短时离心后，42°C温浴 I. 5h，取出后95°C加热5min终止反应。cDNA第一链合成后置于_20°C保存备用。RT-PCR共分析了两个基因，百合3-磷酸甘油醛脱氢酶基因iGAPDH、以及肌动蛋白基因Udi/ )，引物序列、扩增产物长度以及引物退火温度见表I。PCR反应体系如下所示模板(第一链 cDNA) 0. 2u L, IOXBuffer 2 u L, dNTP (IOmM each) 0.5iiL，上游引物(IOuM) 0.2iiL，下游引物(IOiiM) 0.2 U L, Taq DNA polymerase (5U) 0.2 U L, ddH2016. 7 u L0 PCR 反应条件为 94°C 3 min ；94°C 30s，59°C或 63°C 30s, 72°C 50s，30 个循环；72°C 5min。PCR结束后，取8 u L PCR产物在I. 2%TAE琼脂糖凝胶中进行电泳。结果分别见图7和图8，从岷江百合鳞片、西伯利亚百合叶片以及通江百合根中提取总RNA逆转录的cDNA均能成功扩增出看家基因GAPDH、Actin的特异片段，两个基因片段的大小均与预期值相符，表明本发明所提取的RNA质量高，适合进行RT-PCR及其他分子生物学实验。表I :RT-PCR引物序列
权利要求
1.ー种从百合组织中同时提取DNA和RNA的方法，其特征在于它包括以下步骤 (1)取0.5-lg百合植物组织，加入液氮研磨成粉末，按每克组织材料添加12-15ml的异硫氰酸胍提取缓冲液的比例加入预冷的异硫氰酸胍提取液，充分震荡混匀，冰浴10_15min，再加入提取液1/10体积的pH4. 5-5. 5、3molじ1醋酸钠，颠倒混匀；其中异硫氰酸胍提取缓冲液成分为4. 5molじ1异硫氰酸胍，25mmolじ1朽1檬酸钠,0. 5% (w/v)十二烧基肌氨酸钠，3% (w/v)可溶性聚こ烯吡咯烷酮，使用前每IOOmL提取缓冲液加入ImL ^ -巯基こ醇； (2)在步骤(I)得到的混合液中加入与提取液等体积的氯仿，剧烈震荡混匀，冰上放置5min后于4°C 12000g离心IOmin,取上清置于新的离心管中，重复此步骤一次； (3)向步骤(2)中得到的上清液中加入1/3提取液体积的pH4.5-5. 5、8molじ1预冷醋酸钾，颠倒混匀，冰上放置lOmin，4°C 12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中，重复此步骤一次； (4)向步骤(3)得到的上清液中加入与提取液等体积的异丙醇，混匀后-20°C放置30min,接着4°C 12000g离心lOmin,得到核酸粗提沉淀物； (5)用75%的こ醇清洗沉淀两次，室温下干燥20min，用0.5-lmL DEPC处理过的ddH20彻底溶解沉淀； (6)在步骤(5)得到的总核酸溶液中加入0.5-lmLTris饱和酚/氯仿混合液，Tris饱和酚/氯仿混合液中Tris饱和酚与氯仿的体积比为1:1，剧烈震荡混匀，冰上放置5min，于40C 12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中； (7)向步骤(6)的上清液中加入0.5-lmL氯仿，剧烈震荡混匀，冰上放置5min，4°C12000g离心lOmin，取上清置于新的离心管中； (8)向步骤(7)的上清液中加入0.125-0. 25mL IOmolじ1氯化锂，混匀后加入0. 25-0. 5mL无水こ醇，上下颠倒混匀后_20°C放置2h沉淀RNA，4°C 14000g离心15min，取上清液置于新的离心管中； (9)用75%的こ醇清洗步骤(8)得到的RNA沉淀两次，室温下干燥lOmin，用60-100y LDEPC处理过的ddH20溶解RNA沉淀，_80°C保存备用； (10)向步骤(8)得到的上清液中加入0.875-1. 75mL异丙醇和0. 0875-0. 175mLpH4. 5-5. 5的3molじ1醋酸钠，混匀后-20°C放置30min沉淀DNA，室温下12000g离心15min，得到DNA沉淀，用75%こ醇清洗两次，在室温下干燥lOmin，用60-100 u L TE缓冲液溶解，于-20°C保存备用。
2.如权利要求I所述的从百合组织中同时提取DNA和RNA的方法，其特征在于百合植物组织为野生岷江百合幼嫩鳞片、东方百合品种西伯利亚幼嫩叶片、通江百合的幼嫩根中的ー种。
全文摘要
本发明公开了一种同时提取百合组织中DNA和RNA的方法，该方法是利用百合组织样品经过相同的步骤粗提和纯化，得到总核酸溶液，再依次选择性沉淀RNA和DNA，得到高质量的DNA和RNA；本发明方法优点在于所用时间短、经济快速、稳定性好，并且提取的核酸质量高；其特点在于两次利用高浓度醋酸钾沉淀多糖，能有效地去除百合样品中的多糖；在DNA和RNA分离过程中，先用氯化锂和无水乙醇协同作用选择性沉淀RNA，然后利用醋酸钠和异丙醇沉淀DNA，DNA和RNA分离效率高，核酸损失小，且沉淀时间大大缩短。该方法适用于从富含多糖及其他次生代谢物质的百合组织中同时提取DNA和RNA。
文档编号C12N15/10GK102776174SQ20121029646
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者刘亚龙, 刘迪秋, 李红丽, 葛锋, 陈朝银, 饶健 申请人:昆明理工大学