专利名称：一种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法
技术领域：
本发明属于生物技术制菌领域，涉及ー种原生质体融合技术，尤其是ー种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法。
背景技术：
结石是危害人类健康的常见病，正常人尿液中的ー些溶解物质，因各种原因造成沉淀，滞留于肾内，并持续生长，便可形成結石。草酸钙结石是肾结石里最为常见的ー种，占肾结石的80%以上，在酸性或中性尿中形成，它是由饮食中可形成结石的有关成分摄入过多引起的。目前治疗结石的方法主要是采用手术和药物治疗，手术治疗会给人们带来痛苦，药物治疗会给人们带来ー些不良的副作用，因此需要研发出ー种更加便于治疗肾结石的新 手段。1981年dawson首次从绵羊的瘤胃中筛选出产甲酸草酸杆菌Oxalobacterformigenes并对其培养条件进行了研究和对其分解草酸能力进行了測定。2004年Federici发现乳双歧杆菌DSM 10140具有分解草酸的能力；但这两种菌耐氧能力都很差，无法在有氧环境中生长，给生产益生菌产品、防治结石带来了困难。因此，运用微生物育种的方式得到同时具有分解草酸能力并具有耐氧特性的益生菌菌种，意义重大。原生质体融合技术能把亲缘关系比较远，甚至毫无关系的生物体细胞融合在一起，为远缘杂交架起了桥梁，是改造细胞遗传物质的有力手段，它不仅打破了有性杂交重组基因创造新种的界限，更重要的是扩大了遗传物质的重组范围，已经成为遗传育种的重要手段。传统方法采用抗药性标记或营养缺陷标记亲本菌株，不但其工作非常繁琐，而且抗药性标记在益生菌领域的应用又会带来食品安全的问题。目前有较多采用的双亲菌种不同方式灭活处理，如紫外线灭活、热灭活、化学灭活，由于菌株失活机制的不同，根据“致死损伤互补”原则，灭活细胞通过双亲原生质体融合而再生，可生长成具有双亲性状的机能完整的融合子菌株。通过检索,发现与本专利申请相关的如下专利公开文献利用双热灭活亲本通过原生质体融合构建酵母菌株的方法(CN101886069A)，该方法是利用产色酵母和产酒酵母种属的差异，利用双热灭活亲本并用原生质体融合的方式，使双亲本原生质体融合而再生，获得同时具有来源于不同亲本的产色产酒的融合子菌株。其エ艺步骤包括两亲本菌体和两亲本原生质体的制备；两亲本原生质体融合；融合子的检出与挑选和融合子发酵性能测试及复筛。本发明方法操作简单，过程易实现，育种成功几率高；其获得的酵母融合菌株，对于酒精发酵及色素积累过程的代谢调控理论研究及提高酒精发酵生产的管理控制效率都具有积极意义；同时也为酒精エ业及色素生产的菌种选育提供了新的途径。通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种以乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌为亲本、方法操作简便、过程易实现的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，该方法所获得的乳酸菌融合菌株不仅具有分解草酸的能力，同时还具有耐氧的特性。本发明实现目的的技术方案是ー种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，具体步骤如下⑴两亲本菌体的制备分别将乳双歧杆菌(BifidobacteriumIactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)进行液体培养，至细胞浓度为107 109个/ml，得两亲本菌体培养液； ⑵两亲本原生质体的制备将步骤⑴中的两亲本菌体培养液分别洗涤得菌体细胞，再将菌体细胞分别稀释到浓度为10卜IO7个/ml，再分别加入终浓度为5-20mg/ml的溶菌酶并酶解；将两种酶解后的菌体细胞分别洗涤、离心，再分别重悬，即得乳双歧杆菌原生质体和嗜酸乳杆菌原生质体悬液；⑶两亲本原生质体融合将步骤⑵中乳双歧杆菌原生质体悬液和嗜酸乳杆菌原生质体悬液分别灭活后，将两亲本原生质体悬液等体积混合、离心，至原生质体细胞浓度达到10卜107个/ml，得原生质体混和液；然后加入原生质体混和液质量的20-60%的PEG6000、原生质体混和液中终浓度为O. 01-0. 05mol/L的CaCl2和O. 4-0. 9mol/L的NaCl，进行融合得原生质体融合液；将原生质体融合液洗浄，重悬后得融合后的原生质体；⑷融合子的检出与筛选将步骤⑶中原生质体涂布于再生培养基中，培养48-96小吋，将生长出的融合子菌落转接至草酸培养基中，在草酸培养基生长出的菌株即为融合的乳酸菌菌株。而且，所述步骤⑵中酶解条件为酶解温度为30-40°C、转速为100-150r/min，酶解10-60分钟；所述步骤⑶中融合条件为融合温度为15-40°C、转速为100-150r/min，融合10-40分钟。而且，所述步骤⑵中乳双歧杆菌中溶菌酶终浓度为6mg/ml，酶解时间为25分钟，酶解温度为37°C;嗜酸乳杆菌中溶菌酶终浓度为16mg/ml，酶解时间为30分钟，酶解温度为37。。。而且，所述步骤⑵中所使用的溶菌酶为pH为7. 5的PB缓冲液配制，该缓冲液中含有O. 02M HEPES, lmmol/L MgCl2，质量分数为O. 5%的明胶，浓度为O. 5mol/L的乳糖。而且，所述步骤⑶中PEG6000的加入量为原生质体混和液质量的40%、CaCl2的终浓度为原生质体混和液的O. 01-0. 05mol/L、NaCl的终浓度为原生质体混和液的O.4-0. 9mol/L。而且，所述步骤⑶中将乳双歧杆菌原生质体和嗜酸乳杆菌原生质体灭活的具体方法为将乳双歧杆菌原生质体于65-80°C下灭活1-30分钟，将嗜酸乳杆菌原生质体于35CM照射下紫外灭活10-300s。而且，所述乳双歧杆菌原生质体于65°C下灭活10分钟，嗜酸乳杆菌原生质体紫外灭活100s。而且，所述步骤⑷中的再生培养基为不含吐温80的半固体MRS培养基中添加质量百分数为2. 5%的明胶、浓度为20mmol/L MgCl2、浓度为O. 5mol/L的蔗糖。而且，所述步骤⑷中的草酸培养基配方为草酸钠2. 5g/L、葡萄糖I. 5g/L、蛋白胨2g/L、酵母提取物 I. 5g/L、K2HPO4 2g/L、KH2PO4 2g/L、硫酸铵 2g/L 和硫酸锰 O. 025g/L。而且，所述步骤⑷中的原生质体涂布于再生培养基中，培养时间为72小吋。
本发明的优点和有益效果为I、本发明的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，该方法是以乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌为亲本，利用双灭活亲本并用原生质体融合的方式，使双亲本原生质体融合而再生，获得同时具有两亲本性状的乳菌菌菌株，该方法操作简便、过程易实现，可降低生产成本，节约了能耗。2、本发明的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法所制得的融合乳酸菌菌株，不仅具有分解草酸的能力、同时还具有耐氧的特性，因此可以作为预防和治疗结石病的益生菌，这种益生菌的预防和治疗手段不仅没有手术所带来的痛苦，而且也没有药物所帯来的不良副作用，该种乳菌菌菌株给防治结石带来了极大的便利，具有重大的意义。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进ー步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明的实施例中使用的菌株有以下两种具有分解草酸能力的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为DSM 10140，作为亲本A ;具有耐氧特性的嗜酸乳杆菌(LactobaciIIusacidophilus)保藏单位为天津科技大学，作为亲本B。所使用的培养基乳双歧杆菌液体完全培养基蛋白胨10g/L,牛肉膏10g/L,酵母提取物5g/L,葡萄糖 5g/L，K2HP4 O. 45g/L，KH2PO4 O. 33g/L，氯化铵 lg/L，硫酸镁 O. lg/L，L-半胱氨酸 O. 5g/L,蒸懼水1L, pH自然。MRS液体培养基蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物5g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸ニ铵2g/L，こ酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，吐温801ml/L，硫酸镁0. 5g/L，硫酸锰0. 25g/L，pH自然。草酸培养基草酸钠2. 5g/L，葡萄糖1.5g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物I. 5g/L，K2HPO4 2g/L, KH2PO4 2g/L，硫酸铵 2g/L，硫酸锰 0. 025g/L。再生培养基为半固体MRS培养基(不含吐温80)中添加质量百分数为2. 5%的明胶，浓度为20mmol/L MgCl2,浓度为0. 5mol/L的鹿糖。所使用的溶菌酶为pH为7. 5的PB缓冲液配制，该缓冲液中含有0. 02M HEPES,lmmol/LMgCl2，质量分数为0. 5%的明胶，浓度为0. 5mol/L的乳糖。
实施例Iー种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，具体步骤如下⑴两亲本菌体的制备分别将具有草酸分解能力的乳双歧杆菌接种于乳双歧杆菌液体完全培养基、具有耐氧特性的嗜酸乳杆菌接种于MRS液体培养基，37°C静置培养16小时后，待生长到对数期后，制得细胞浓度为107 109个/ml的菌悬液，得到两亲本菌体；⑵两亲本原生质体的制备将步骤⑴获得的两亲本菌体培养液分别用PB缓冲液离心洗涤三次，再将洗涤的菌体细胞分别稀释到浓度为10卜IO7个/ml，各取5ml稀释后的菌悬液，在乳双歧杆菌菌悬液 中加入终浓度为6mg/ml的溶菌酶，轻摇使菌体和酶液充分混合，再置于温度30°C、转速为100r/min的恒温摇床中，酶解10分钟；在嗜酸乳杆菌菌悬液中加入终浓度为16mg/ml的溶菌酶酶解，轻摇使菌体和酶液充分混合，再置于温度30°C、转速为lOOr/min的恒温摇床中，酶解10分钟；然后将两种酶解后的菌体细胞分别悬液置于4°C冷冻离心机中用PB缓冲液洗涤两次，离心洗涤条件为3000r/min、10分钟，再将其分别悬于5ml PB缓冲液中，即得两亲本原生质体；⑶两亲本原生质体融合于70°C下对乳双歧杆菌原生质体灭活20分钟，于35CM照射下嗜酸乳杆菌紫外灭活IOOs后，使两亲本原生质体灭活率到达100%，将两亲本原生质体悬液在离心管中等体积混合，于4°C冷冻离心机中3000r/min离心10分钟，然后加入融合体系中原生质体混和液质量的20%的PEG6000、融合体系中原生质体混和液中终浓度为O. Olmol/L的CaCl2和O. 4mol/L的NaCl，融合前需使亲本的原生质体细胞浓度达到10卜107个/ml，混匀后放入15°C、转速为100r/min的恒温摇床中，10分钟以待融合；取出融合后的原生质体悬液，放入4°C冷冻离心机中，在3000r/min、10分钟条件下用PB缓冲液离心洗涤两次，以将融合剂洗净，将洗涤后的原生质体重悬于PB缓冲液中，得到融合后的原生质体；在使用融合剂融合两亲本原生质体时，若细胞浓度小于10卜107个/ml范围时，则离心压缩；若细胞浓度大于10卜107个/ml范围时，则加入PB缓冲液稀释；⑷融合子的检出与筛选先将融合后的原生质体悬液涂布于具有再生培养基的平皿中，培养48小吋，由于原生质体灭活达到100%，再生生长出来的菌落即为融合子，将生长出来的融合子菌落转接至草酸培养基中，能够在草酸培养基生长的菌株即为具有分解草酸能力且具有耐氧特性的融合乳酸菌；由于乳双歧杆菌不具有耐氧特性无法在平板培养基上生长，草酸对嗜酸乳杆菌的生长具有毒害作用，不能在草酸培养基上生长，因此设计草酸平板培养基能够在有氧条件下培养可以筛选出同时能够分解草酸和具有耐氧特性的融合子；(5)融合子分解草酸性能测试将融合子乳酸菌菌株转接到草酸培养基中于37°C培养5天后，使用高效液相色谱法检测草酸培养基发酵前后的草酸含量，高效液相色谱法条件如下色谱柱C18柱 5 μ m, 250 X 4. 6mm
pH 范围2-10流动相2%H3P04的去离子水甲醇(V/V)=99. 5:0. 5检测器波长2IOnm流速0.5mT ,/mi η结果再生平板上生长出55个融合子菌落，双亲本原生质体由于灭活后无法在再生平板上再生，所以55个菌落都可确定是融合子，将融合子转接到草酸平板上，其中有9株菌可以在草酸平板上生长，同时验证了这9株菌是可以在有氧环境下生长的，这9株融合子就是同是具有分解草酸能力和耐氧特性的融合菌。乳双歧杆菌在草酸培养基中培养3天后，经高效液相色谱法检测，培养基中草酸 消耗了 12%。表19株融合菌在草酸培养基培养3天后经高效液相色谱法检测培养基草酸消耗量
编号 SZYl-I SZYl-2 SZY1-3 SZYI-4 SZY1-5 SZYI-6 SZYI-7 SZY1-8 SZY1-9
草酸分解
11.9% 2.3% 5.6% 10.8% 7 )° 8.6% 13.4% 10.5% 6.7%
里由表I可知编号为SZY1-1、SZY1-4、SZY1-7、SZYI-8的融合菌分解草酸的能力与亲本比较接近，又同时可以在有氧环境下生长，为成功构建的融合菌。实施例2ー种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，具体步骤如下⑴两亲本菌体的制备分别将具有草酸分解能力的乳双歧杆菌接种于乳双歧杆菌液体完全培养基、具有耐氧特性的嗜酸乳杆菌接种于MRS液体培养基，37°C静置培养16小时后，待生长到对数期后，制得细胞浓度为107 109个/ml的菌悬液，得到两亲本菌体；⑵两亲本原生质体的制备将步骤⑴获得的两亲本菌体培养液分别用PB缓冲液离心洗涤三次，再将洗涤的菌体细胞分别稀释到浓度为10卜IO7个/ml，各取5ml稀释后的菌悬液，在乳双歧杆菌菌悬液中加入终浓度为6mg/ml的溶菌酶，轻摇使菌体和酶液充分混合，再置于温度37°C、转速为120r/min的恒温摇床中，酶解25分钟；在嗜酸乳杆菌菌悬液中加入终浓度为16mg/ml的溶菌酶酶解，轻摇使菌体和酶液充分混合，再置于温度37°C、转速为120r/min的恒温摇床中，酶解30分钟；然后将两种酶解后的菌体细胞分别悬液置于4°C冷冻离心机中用PB缓冲液洗涤两次，离心洗涤条件为3000r/min、10分钟，再将其分别悬于5ml PB缓冲液中，即得两亲本原生质体；⑶两亲本原生质体融合于65°C下对乳双歧杆菌原生质体灭活10分钟，于35CM照射下嗜酸乳杆菌紫外灭活IOOs后，使两亲本原生质体灭活率到达100%，将两亲本原生质体悬液在离心管中等体积混合，于4°C冷冻离心机中3000r/min离心10分钟，然后加入融合体系中原生质体混和液质量的20%的PEG6000、融合体系中原生质体混和液中终浓度为O. 01mol/L的CaCl2和O. 4mol/L的NaCl，融合前需使亲本的原生质体细胞浓度达到10卜107个/ml，混匀后放入25°C、转速为120r/min的恒温摇床中，15分钟以待融合；取出融合后的原生质体悬液，放入4°C冷冻离心机中，在3000r/min、10分钟条件下用PB缓冲液离心洗涤两次，以将融合剂洗净，将洗涤后的原生质体重悬于PB缓冲液中，得到融合后的原生质体；在使用融合剂融合两亲本原生质体时，若细胞浓度小于10卜107个/ml范围时，则离心压缩；若细胞浓度大于10卜107个/ml范围时，则加入PB缓冲液稀释；⑷融合子的检出与筛选先将融合后的原生质体悬液涂布于具有再生培养基的平皿中，培养72小时，由于原生质体灭活达到100%，再生生长出来的菌落即为融合子，将生长出来的融合子菌落转接至草酸培养基中，能够在草酸培养基生长的菌株即为具有分解草酸能力且具有耐氧特性的融合乳酸菌； 由于乳双歧杆菌不具有耐氧特性无法在平板培养基上生长，草酸对嗜酸乳杆菌的生长具有毒害作用，不能在草酸培养基上生长，因此设计草酸平板培养基能够在有氧条件下培养可以筛选出同时能够分解草酸和具有耐氧特性的融合子；(5)融合子分解草酸性能测试将融合子乳酸菌菌株转接到草酸培养基中于37°C培养5天后，使用高效液相色谱法检测草酸培养基发酵前后的草酸含量，高效液相色谱法条件如下色谱柱C18柱 5ym，250X4.6mmpH 范围2-10流动相2%H3P04的去离子水:甲醇(V/V) =99. 5:0. 5检测器波长2IOnm流速0.5mT ,/mi η结果再生平板上生长出79个融合子菌落，双亲本原生质体由于灭活后无法在再生平板上再生，所以75个菌落都可确定是融合子，将融合子转接到草酸平板上，其中有7株菌可以在草酸平板上生长，同时验证了这7株菌是可以在有氧环境下生长的，这7株融合子就是同是具有分解草酸能力和耐氧特性的融合菌。乳双歧杆菌在草酸培养基中培养3天后，经高效液相色谱法检测，培养基中草酸消耗了 12%。表27株融合菌在草酸培养基培养3天后经高效液相色谱法检测培养基草酸消耗量
权利要求
1.一种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于具体步骤如下 ⑴两亲本菌体的制备 分别将乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)进行液体培养，至细胞浓度为107 109个/ml，得两亲本菌体培养液； ⑵两亲本原生质体的制备 将步骤⑴中的两亲本菌体培养液分别洗涤得菌体细胞，再将菌体细胞分别稀释到浓度为10卜107个/ml，再分别加入终浓度为5-20mg/ml的溶菌酶并酶解；将两种酶解后的菌体细胞分别洗涤、离心，再分别重悬，即得乳双歧杆菌原生质体和嗜酸乳杆菌原生质体悬液； ⑶两亲本原生质体融合 将步骤⑵中乳双歧杆菌原生质体悬液和嗜酸乳杆菌原生质体悬液分别灭活后，将两亲本原生质体悬液等体积混合、离心，至原生质体细胞浓度达到10卜107个/ml，得原生质体混和液； 然后加入原生质体混和液质量的20-60%的PEG6000、原生质体混和液中终浓度为O.01-0. 05mol/L的CaCl2和O. 4-0. 9mol/L的NaCl，进行融合得原生质体融合液； 将原生质体融合液洗净，重悬后得融合后的原生质体； ⑷融合子的检出与筛选 将步骤⑶中原生质体涂布于再生培养基中，培养48-96小时，将生长出的融合子菌落转接至草酸培养基中，在草酸培养基生长出的菌株即为融合的乳酸菌菌株。
2.根据权利要求I所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于所述步骤⑵中酶解条件为酶解温度为30-40°C、转速为100-150r/min，酶解10-60分钟；所述步骤⑶中融合条件为融合温度为15-40°C、转速为100-150r/min，融合10-40分钟。
3.根据权利要求I所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于所述步骤⑵中乳双歧杆菌中溶菌酶终浓度为6mg/ml，酶解时间为25分钟，酶解温度为37°C;嗜酸乳杆菌中溶菌酶终浓度为16mg/ml，酶解时间为30分钟，酶解温度为37。。。
4.根据权利要求I所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于所述步骤⑵中所使用的溶菌酶为pH为7. 5的PB缓冲液配制，该缓冲液中含有O. 02M HEPES, lmmol/L MgCl2，质量分数为O. 5%的明胶，浓度为O. 5mol/L的乳糖。
5.根据权利要求I所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于所述步骤⑶中PEG6000的加入量为原生质体混和液质量的40%、CaCl2的终浓度为原生质体混和液的O. 01-0. 05mol/L、NaCl的终浓度为原生质体混和液的O.4-0. 9mol/L。
6.根据权利要求I所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于所述步骤⑶中将乳双歧杆菌原生质体和嗜酸乳杆菌原生质体灭活的具体方法为将乳双歧杆菌原生质体于65-80°C下灭活1-30分钟，将嗜酸乳杆菌原生质体于35CM照射下紫外灭活10-300S。
7.根据权利要求6所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于所述乳双歧杆菌原生质体于65°C下灭活10分钟，嗜酸乳杆菌原生质体紫外灭活100s。
8.根据权利要求I所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于所述步骤⑷中的再生培养基为不含吐温80的半固体MRS培养基中添加质量百分数为2. 5%的明胶、浓度为20mmol/L MgCl2、浓度为O. 5mol/L的蔗糖。
9.根据权利要求I所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于所述步骤⑷中的草酸培养基配方为草酸钠2. 5g/L、葡萄糖I. 5g/L、蛋白胨 2g/L、酵母提取物 I. 5g/L、K2HPO4 2g/L、KH2PO4 2g/L、硫酸铵 2g/L 和硫酸锰 O. 025g/L。
10.根据权利要求I所述的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于所述步骤⑷中的原生质体涂布于再生培养基中，培养时间为72小时。
全文摘要
本发明涉及一种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，具体步骤如下⑴两亲本菌体的制备，即乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的制备；⑵两亲本原生质体的制备；⑶两亲本原生质体融合；⑷融合子的检出与筛选。本发明的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，该方法是以乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌为亲本，利用双灭活亲本并用原生质体融合的方式，使双亲本原生质体融合而再生，获得同时具有两亲本性状的乳菌菌菌株，该方法操作简便、过程易实现，可降低生产成本，节约了能耗。
文档编号C12R1/23GK102816753SQ20121030132
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月22日 优先权日2012年8月22日
发明者路福平, 聂实践, 毛淑红, 张禹, 李玉, 刘逸寒 申请人:天津科技大学, 北京百林康源生物技术有限责任公司