专利名称：一种利用球拟酵母发酵制备乙醇的方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用球拟酵母发酵制备乙醇的方法。
背景技术：
丙酮酸(Pyruvicacid),又称 2_ 氧代丙酸(2_oxopropanoic acid)、α -酮基丙酸(a-ketopropionic acid)或乙酸基甲酸(Acetylformic acid),为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，见光色变深，易吸潮、聚合、分解，能与水、乙醇、乙醚混溶。其熔点11.8°C，沸点165°C(分解)。分子式C3H4O3，分子量为85. 06，是最重要的α-氧代羧酸之一。生物发酵法生产丙酮酸的研究起始于20世纪50年代，主要是采用代谢控制育种技术切断丙酮酸的进一步代谢途径，解除丙酮酸末端产物对限速酶的反馈调节来选育丙酮酸的高产菌株。 发酵法生产丙酮酸研究真正取得进展是在1988年。当时日本东丽工业株式社(Toray Industries Inc.)研究人员宫田令子(Yonehara)和米原辙(Miyata)选育出一系列的丙酮酸产量超过50 g/L的球拟酵母菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。1992年，日本率先实现了发酵法生产丙酮酸的工业化。生物发酵法生产丙酮酸具有污染小、以葡萄糖为底物、成本低等优点，是一条极有发展前景的方法，因此近年来人们把目光聚焦到发酵法生产丙酮酸的研究上。我国虽然也有这方面的研究报道，但是几乎没有企业进行工业化生产。
发明内容
本发明提供了一种利用球拟酵母发酵制备乙醇的方法，本发明以球拟酵母为出发菌株，对发酵条件进行研究。I. 一种利用球拟酵母发酵制备乙醇的方法，其特征在于发酵时，在250 mL三角瓶装入50 mL发酵培养基,接入一定量的一定种龄的种子液,将其置于一定温度、一定转速下进行摇瓶振荡培养，发酵48 h02.步骤I所述的种子液的制备过程从刚转接好的新鲜斜面上挑取一环菌种，接Λ 50 mL种子培养基中，置于摇床上在30°C、160 r/min，振荡培养24 h。3.步骤I所述的发酵培养基的制备葡萄糖120 g、(NH4)2SO4 8 g、KH2PO4 2 g、MgSO4 · 7Η200· 3 g、ZnCl25 mg, CaCl2 50 mg、FeS04 40 mg、CuS04 4 mg、MnC12 3 mg、盐酸硫铵素 0. 02 mg、盐酸吡哆醇 0. 50 mg、生物素 0. 02 mg、烟酸 8. 00 mg、水 I 000 mL, pH 5. 5。4.步骤2所述的种子培养基的制备葡萄糖40 g、蛋白胨5. 00 g、MgS04 ·7Η20 0. 30g、KH2PO4 I. 00 g、水 I 000 mL, pH 5.0。5.步骤I所述的最佳种龄为26 h。6.步骤I所述的最佳接种量为12%。7.步骤I所述的最佳发酵温度为32°C。8.步骤I所述的最佳转速为240 rpm。
本发明对发酵条件如接种量选择、种龄选择，搅拌转速、温度等条件进行了研究，为以后的工业化鉴定基础。
图I 一级种子生长曲线。图2不同接种量对丙酮酸产量的影响。图3不同温度对丙酮酸产量的影响。图4不同摇瓶转速对丙酮酸产量的影响。
具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。 本发明所用的菌株为球拟酵母，购买于ACCC，编号为ACCC20343。实施例I
本实施案例说明种龄对丙酮酸产量的影响，一级种子生长曲线如图I所示，从图I可知，对数生长末期大概在22-24 h左右；装液量100 mL的种子培养基在菌浓以及速度方面均较优，考虑可能是溶氧问题。在250 mL三角瓶装入50 mL，取9%的接种量接入发酵培养基，发酵温度为30°C，160 rpm发酵48 h，选择100 mL装液量的种子瓶22、24、26、28 h的种子接入发酵摇瓶中发酵，测定丙酮酸浓度，以确定合适的接种种龄，发酵48 h，结果如表I所示
由表I可以看出，种龄24 h与26 h的丙酮酸浓度相差不大，22 h略小，估计为种子过于幼嫩所致，28 h种子过老产酸也较低，综合考虑上述因素，选择菌龄为26 h的种子接入发酵瓶。表I不同种龄发酵产酸比较
I^Kh)|22 |24 |26 丨28
Wli酸(g/L) |59. 21 ΙθΟ. 34 \&2. 85 |53. 76
实施例2
本实施案例说明不同接种量对丙酮酸产量的影响，在250 mL三角瓶装入50 mL，取26h的种子接入发酵培养基，发酵温度为30°C，160 rpm发酵48 h，分别取接种量为3%、6%、9%、12%、15%、18%和21%，不同种子液接种量对丙酮酸摇瓶发酵的影响如图2所示。由图2可见，随着丙酮酸一级摇瓶种子液接种量的增大，固定时间内丙酮酸产量也增大，种子液接种量为12%时，菌丝体产量最高，随着接种量继续增大，丙酮酸产量有逐渐下降的趋势，考虑应该是代谢产物过多引起的产量下降。综合考虑发酵时间长短和生产成本的因素，确定12%的种子液接种量为其最适种子液接种量。实施例3
本实施案例说明不同温度对丙酮酸产量的影响，在250 mL三角瓶装入50 mL，取26 h的种子12%接种量接入发酵培养基，分别取发酵温度为24°C、26°C、28 V、30°C、32 V、34°C和36。。，160 rpm发酵48 h，结果如图3所示。由图3可见，发酵温度对丙酮酸产量有较大的影响，随着温度的升高，丙酮酸产量不断增加，但在32°C后继续升温，丙酮酸产量反而降低，因而确定32°C为其最适发酵温度。实施例4本实施案例说明不同摇瓶转速对丙酮酸产量的影响，在250 mL三角瓶装入50 mL，取26 h的种子12%接种量接入发酵培养基，发酵温度为32°C，转速分别为120 rpm、140 rpm、160 rpm> 180 rpm、200 rpm、220 rpm、240 rpm、260 rpm 和 280 rpm,发酵 48 h,结果如图 4所示。 由图4可见，随着转速增加，通气量和溶解氧增大丙酮酸产量增大。当转速达240rpm时,丙酮酸产量最高,接下来转速增加并不能让丙酮酸产量继续提高。因而确定240 rpm
为其最适摇瓶转速。
权利要求
1.一种利用球拟酵母发酵制备乙醇的方法，其特征在于发酵时，在250 mL三角瓶装入50 mL发酵培养基,接入一定量的一定种龄的种子液,将其置于一定温度、一定转速下进行摇瓶振荡培养，发酵48 ho
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，种子液的制备过程从刚转接好的新鲜斜面上挑取一环菌种，接入50 mL种子培养基中，置于摇床上在30°C、160 r/min，振荡培养24h0
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵培养基的制备葡萄糖120g、(NH4)2SO4 8 g、KH2PO4 2 g、MgSO4 · 7Η200· 3 g、ZnCl25 mg、CaCl2 50 mg、FeSO4 40 mg、CuSO44 mg、MnCl2 3 mg、盐酸硫铵素0. 02 mg、盐酸批P多醇0. 50 mg、生物素0.02 mg、烟酸8. 00mg、水 I 000 mL, pH 5· 5。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，种子培养基的制备葡萄糖40g、蛋白胨5. 00 g, MgSO4 · 7H20 O. 30 g、KH2PO4 I. 00 g、水 I 000 mL, pH 5. O。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，种龄为26h。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，接种量为12%。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵温度为32°C。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，转速为240rpm。
全文摘要
本发明提供了一种利用球拟酵母发酵制备乙醇的方法，本发明以球拟酵母为出发菌株，对发酵条件进行研究。
文档编号C12R1/645GK102851321SQ20121030459
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者周雪琴 申请人:太仓市周氏化学品有限公司