专利名称：Celligen310生物反应器制备人二倍体细胞狂犬病疫苗工艺的制作方法
Cel I igen310生物反应器制备人二倍体细胞狂犬病疫苗工
-H-
1.发明领域本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Celligen310)生物反应器制备人二倍体细胞狂犬病疫苗工艺。2.
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种人兽共患传染病，是世界上病死率最高的疾病，一般被携带病毒的动物咬伤后感染。一旦发病，死亡率为100%。狂犬病在世界范围内广泛分布，不同种族的人群对狂犬病均有普遍易感性，流行区域以亚洲、非洲和拉丁美洲为主。我国仅次于印度，为世界第二发病率高的国家。近年米，我国狂犬病疫情一直呈上升趋势，病死数高居我国37种法定报告传染病首位。幸运的是适当接种狂犬病疫苗对狂犬病也有近乎100%的保护率，提高人群和动物的疫苗接种率对控制狂犬病流行具有决定性意义。在条件许可的情况下对人群的普遍性预防性接种，可望避免由狂犬病引其的人员死亡。目前我国预防接种的疫苗绝大部分是由动物细胞作为基质生产而来。这些疫苗普遍存在局部过敏反应，有时会出现发热等全身性副作用，甚至有潜在的致肿瘤危险。尽管狂犬病是高致死性疾病、疫苗接种为唯一的控制方法、对于被咬伤人员疫苗接种没有绝对的禁忌症。但是世界卫生组织不推荐人们在被咬伤前使用这些疫苗，推荐使用人二倍体细胞培养的疫苗作为暴露前的预防接种疫苗。人二倍体细胞狂犬疫苗(humandiploid cell rabies vaccine, HDCV)在所有现行使用的疫苗中已公认最为安全和有效。临床药理试验证明HDCV可以迅速诱导人体特异性抗体的产生。HDCV是国际狂犬疫苗的金标准，是评价所有人用狂犬疫苗的标准疫苗。适应于暴露前免疫，初次免疫和定期加强免疫，暴露后预防接种。
3.
发明内容
本发明公开一种Celligen310生物反应器制备人二倍体细胞狂犬病疫苗工艺，采用Celligen310生物反应器培养人二倍体细胞，接种狂犬病毒PM毒株毒种，经过接种、培养、收集病毒滤液，再经过灭活、浓缩、纯化，检定合格后制成品疫苗。本发明的优点在于使用人二倍体细胞作为基质细胞，制备的疫苗与传统动物源性基质细胞制备疫苗比较比较，后续纯化制备工艺简单，疫苗产品具有更大的安全性。使用Celligen310生物反应器制备疫苗，与传统方法比较成本较低，更容易工业化生产。具体的，本发明涉及了一种Celligen310生物反应器制备人二倍体细胞狂犬病疫苗的制备方法，其包括如下步骤:1)复苏培养人二倍体细胞为产毒细胞；2)PM株病毒种子制备，建立适应于二倍体细胞的PM株病毒种子，确认其免疫、遗传和增殖特性；3)Celligen310生物反应器扩增培养人二倍体细胞，接种、培养以及收获病毒原液；4)将病毒原液进行灭活、除菌、浓缩和纯化；以及5)加入保护液，并检定合格后制备成品疫苗。本发明所述的制 备工艺，产品质量标准以2010年《中国药典》第三部狂犬病疫苗规程质量标准为基础。疫苗主要技术指标:病毒滴度> 7.01gLD50/mL ;疫苗免疫剂量:0.5mL/人；抗生素残留量:彡50ng/剂；牛血清残留量:彡50ng/剂；热原:彡50EU/mL ;疫苗pH:7.6 7.8热稳定性:符合2010年药典第三部标准，合格；疫苗效力:彡2.5IU/剂；无菌检查:符合2010年药典第三部标准，合格。支原体检查:符合2010年药典第三部标准，合格；异常毒性试验:符合2010年药典第三部标准，合格。鉴别试验:合格。
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图1为Celligen310生物反应器制备人二倍体细胞狂犬病疫苗工艺流程图。
5.
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。本实施例仅仅用于对本发明的说明，不构成对本发明的限制。实施例1:取冻存人二倍体细胞，37°C解冻，加入37 °C预热的MEM培养基(Invitrogen)。1000RPM离心10分钟，收集细胞，新用ImL完全培养基(MEM培养基加上10%胎牛血清、0.3%水解乳蛋白、l%NaHC03、2 mMOL谷氨酰胺溶液)悬浮，进行细胞计数，按1.5X IOVmL细胞接种到每个含IOmL完全培养基的25cm2细胞培养瓶。置于37°C，5%CO2相对湿度90%细胞培养箱培养。当细胞形成完全单层时，倒掉培养基，加入0.25%胰蛋白酶(Invitrogen) (PH7.6 7.8)，消 化到细胞单层表面出现针孔样时加入IOmL MEM培养基吹到形成单细胞悬液，1000RPM离心10分钟，收集细胞，ImL完全培养基悬浮，进行细胞计数，每个含OmL完全培养基的25cm2细胞培养瓶接种1.5 X 106/mL细胞，标明时间和世代，置于37°C，5% CO2相对湿度90%细胞培养箱培养。细胞形成完全单层时，常规消化制备单细胞悬液，按1: 2或1: 4进行细胞传代，37°C培养。实施例2:PM株病毒种子制备狂犬病毒PM株购买于美国Wistar研究所。按照疫苗制备的要求，首先建立适应于人类二倍体细胞的PM适应病毒株。将上述方法传代的细胞接种PM毒株，MOI为0.01 0.001，调整PH至7.6 7.8后放入33°C 35°C进行培养。96 120小时以后收获病毒，取样，用小鼠病内接种法检查病毒滴度，其IgLD5tlAiL为彡7.0。鉴别试验用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性。将毒种作10倍系列稀释，取适宜稀释度病毒液与等量狂犬病病毒特异性免疫血清混合，同时设立正常血清对照组，试验组与对照组的每个稀释度分别接种11 13g小鼠6只，每只脑内接种0.03mL，观察14天，中和指数应不低于500。病毒滴定取毒种作10倍系列稀释，每个稀释度脑内接种体重为11 13g小鼠至少6只，每只脑内接种0.03mL，观察14天，病毒滴度应不低于7.01gLD5(l/mL。免疫原性检查。用主种子批毒种制备灭活疫苗，腹腔注射体重为12 14g小鼠，每只0.5mL。7天后重复接种I次作为试验组，未经免疫小鼠做对照组。第一次免疫后的第14天，试验组和对照组分别用10倍系列稀释的CVS病毒脑腔攻击，每只0.03mL，每个稀释度10只小鼠。保护指数应不低于100。
病毒滴度合格的毒种合并做各项检定,合格后即为毒种。冻于后至_60°C保存。收获的病毒从5代以后，每5代进行免疫原性检查和DNA序列分析。选择稳定代次作为主代毒种和工作种子。实施例3:Celligen310生物反应器扩增培养人二倍体细胞采用Celligen310生物反应器培养人二倍体细胞。经上面方法扩增的细胞接种到装有完全培养基的Celligen310生物反应器中，置于37°C细胞培养。当细胞长满以后，用磷酸盐缓冲液(PBS)对细胞表面进行冲洗。然后换入新的培养液，培养液调整pH至7.6 7.8。实施例4:接种病毒
接种人二倍体细胞适应PM株毒种的MOI为0.01 0.001。接种病毒后的细胞置33°C 35 °C进行培养。实施例5:收获的病毒液。病毒培养96 120小时后收获病毒培养液,取样对病毒进行滴定。以灌注方法补充新的培养液，如此可多次收获病毒，直至细胞脱落为止。实施例6:病毒灭活采用1: 4000的β -丙内酯灭活，2 8°C 72小时灭活病毒。检验灭活效果，将灭活的病毒液接种小鼠脑腔，并盲传3代，当小鼠全部存活，说明病毒已完全被灭活。实施例7:病毒液浓缩、纯化:收获的病毒液用经过截留分子量300KD以上分子的超滤器(Minipore，USA)超滤浓缩。先并把病毒液浓缩到一定倍数，然后加入适量的PBS稀释冲洗，然后浓缩到原倍数，再加入适量的PBS冲洗，如此反复4 6次，除去绝大部分残留的牛血清蛋白。用Sepharose4ff (GE Healthcare Life Sciences)凝胶层析进一步去除疫苗中的小分子杂质与残留的牛血清蛋白，用BSA ELISA检测试剂盒(博生公司，无锡)检测牛血清残留量，应低于《国家药典》规程< 50ng/剂的要求。然后加入0.1%人白蛋白作为疫苗保护液即为疫苗原液。取样做无菌试验、总蛋白含量、安全试验、效力试验等检测。放置2 8°C保存。实施例8:疫苗的制备与分装检测合格后的疫苗原加入保护剂按2.5IU/剂分装冻干。冻干后，抽样进行检定，各项指标合格后即为成品疫苗。本产品质量标准以2010年《中国药典》第三部狂犬病疫苗规程质量标准为基础。疫苗主要技术指标:病母滴度≥7.0lgLD50O疫苗免疫剂量:0.5mL/人。抗生素残留量.≤50ng/剂。牛血清残留量≤50ng/剂。热原:<50EU。疫苗pH: 7.6 7.8。热稳定性:符合2010年药典第三部标准，合格。疫苗效力:≥2.5IU/剂。
无菌检查:符合2010年药典第三部标准，合格。支原体检查:符合2010年药典第三部标准，合格。异常毒性试验:符合2010年药典第三部标准，合格。鉴别 试验:合格。
权利要求
1.一种狂犬病毒纯化灭活度苗的制备方法，包括如下步骤:采用Celligen310生物反应器培养人二倍体W1-38或MRC-5(以下简称人二倍体细胞)作为为产毒细胞，以狂犬病毒PM株作为毒种，经过接种、培养、收集病毒滤液，再经过浓缩纯化并加入保护液制备得到成品疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述的狂犬病毒PM株为由美国Wistar研究所提供并许可用于生产的，所述的人二培体细胞毒种为通过人二倍体细胞传代适应的狂犬病毒PM株毒种，所述毒种滴度按IgLD5tlAil法不低于7.0。
3.根据权利要求1所述的制备方法，所述狂犬病毒纯化灭活度苗的具体培养方法为: 1)将人二倍体细胞在Celligen310生物反应器上培养，使之成为致密的单层细胞，然后接种病毒种子，即狂犬病毒PM株； 2)在33 35°C的适宜温度下培养病毒，到期后，以灌注法多次收获病毒； 3)收获的病毒先利用连续流离心方法去除细胞杂质，再经超滤300KD超滤膜浓缩，然后利用蔗糖密度梯度离心纯化，最后经4FF凝胶柱层析进一步纯化； 4)纯垢的病毒利用β-丙内酯72小时灭活； 5)过滤除菌后即为原液； 6)各项检定合格后，加入保护剂 ，分装冻干； 7)冻干后制品检定合格后即为成品疫苗； 其中，将所述疫苗按照2010年《中国药典》第三部狂犬病疫苗规程质量标准进行检测，得到的疫苗主要技术指标为:病毒滴度7.0lgLD5tlAiL ;疫苗免疫剂量:0.5mL/人；抗生素残留量50ng/剂；牛血清残留量:50ng/剂；热原50EU ;疫苗pH:7.6 7.8 ;热稳定性符合2010年药典第三部标准，合格；疫苗效力:^ 2.5IU/剂；无菌检查:符合2010年药典第三部标准，合格；支原体检查:符合2010年药典第三部标准，合格；异活毒性试验:符合2010年药典第三部标准，合格；鉴别试验:合格。
全文摘要
本发明属于生物制品领域，具体涉及一种使用Celligen310生物反应器培养人二倍本WI-38，MRC-5(以下称为人二倍体细胞)为产毒细胞、以狂犬病毒PM株为毒种制备狂犬病疫苗的工艺。包括人二倍体细胞的复苏；人二倍体细胞培养扩增；在人二倍体细胞上接种狂犬病毒PM株毒种；病毒种子驯化、接种、培养、收集病毒滤液，再经过灭活、纯化、浓缩以及加入保护液等步骤制备成品疫苗。疫苗检定指标符合2010版《中国药典》标准。该工艺特征在于，使用Celligen310生物反应器培养制备人源二倍体细胞作为基质细胞，可以避免动物传代细胞的外源污染因子和致瘤性。疫苗在制备过程中接种的病毒毒株为狂犬病毒PM株，免疫效果较传统疫苗更好。使用该工艺制备的疫苗具有纯度高、免疫效果好、安全性高的优点。
文档编号C12N7/00GK103083654SQ20121030650
公开日2013年5月8日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者刘孝民, 刘培生 申请人:万里明