专利名称：一株海洋真菌小红酵母及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株新的具有抗肿瘤活性的海洋真菌-小红酵母(Rhodotorula
minuta ) 100101A,及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
从陆地微生物中寻找新的抗肿瘤药物的成功率已大大降低，而海洋微生物作为新的药物来源正越来越受到世界关注。海洋环境苛刻，具有低温、低照、高盐、高压和寡营养等特点，海洋微生物由于栖息于这样的极限环境下，产生了与陆地生物完全不同的代谢系统和机体防御系统，所以能产生许多结构新颖、活性特异的次级代谢产物，并且许多特异的化学结构类型是在陆地微生物中难以发现的。同时据研究，海洋微生物产生的次级代谢产物具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌等生物活性也是陆生微生物所无法比拟的。
海洋微生物作为抗肿瘤活性物质的新来源，受到了全世界海洋研究工作者的关注。
发明内容
本发明的目的即是为了在海洋微生物中寻找具有抗肿瘤活性的物质，提供一株抗
肿瘤活性海洋真菌-小红酵母(Rhodotorula minuta )100101A及其应用，为研究开发新
型抗肿瘤药物提供先导化合物。本发明采用的技术方案是一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌-小红酵母(Rhodotorula minuta) 100101A,
保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No M 2012289，保藏日期2012 年 7 月 18 日。该菌株的菌落特征如下涂布或划线接种于平板培养基上生长迅速，28°C培养48 h后长出圆形、湿润、淡红色、易挑起，直径约为O. 5-0. 8cm的菌落；所述小红酵母Rhodotorula minuta 100101A细胞特征如下椭圆形，单球菌，大小为
2.3-5. O μ mX 4. 0—10. O μ m。本发明小红酵母100101A是从浙江省东海海域采集的海水中筛选分离得到。菌株的筛选纯化方法为将采集的海水运用稀释涂布法涂于土豆平板培养基上，多次平板划线至出现单菌落，再挑取单菌落至新鲜土豆斜面培养基上，28°C培养48h，以菌株形态特征区别进行挑选，即得该菌株，并对该菌株进行菌种鉴定。将所述的小红酵母Rhodotorula minuta 100101A的18sRNA部分核苷酸序列与美国国立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information USA, NCBI)的基因库中的微生物18sRNA序列比对，将其命名为海洋小红酵母Rhodotorula minuta100101A。所述小红酵母Rhodotorula minuta 100101A的18sRNA的部分核苷酸序如下
CTTCCGTAAGGGTAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAATTTTAGGACGTTCTTTTTAGAAGTCCGACCATTTCATTTTCTTACACTGTGCACACACTTCTTTTTACACACACTTTTAACACATTAGTATAAGAATGTAATAGTCTCTTAATTGAGCATAAACAAAAATAAAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACC TTGCACTCTTTGGTATTCCGAAGAGTATGTCTGTTTGAGTATCATGAAACTCTCAACCCCCCTATTTTGTAATGAAATGGGCGTGGGCTTGGATTATGGTTGTCTGTCGGCGTAATTGCCGGCTCAACTGAAATACACGAGCAACCCTATTGAAATAGACGGTTTGACTTGGCGTAATAATTATTTCGCTAAGGACGTCTTCTTCAAATATAAGAGGTGCTTCTAATGCGCTTTATAGCACTTTAAGCTTTAGATCTCAAATCAGT CAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAGGCGGAGGAAGA。本发明还涉及所述的小红酵母100101A在制备抗肿瘤药物中的应用。所述抗肿瘤药物为治疗神经癌或肝癌的药物。具体的，所述应用为所述小红酵母100101A提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，所述提取物为正丁醇提取物，由如下方法获得小红酵母100101A接种至液体发酵培养基，于25 35°C、15(T250r/min振荡条件下培养14 30天，得到发酵液，发酵液经细胞破碎，离心取滤液用正丁醇萃取，萃取液浓缩得浸膏，浸膏以甲醇水体积比为2 8^10 0为流动相，进行HP-20大孔树脂层析过柱，梯度洗脱，收集甲醇体积浓度80%以上的洗脱液，旋蒸浓缩挥干，即得所述正丁醇提取物；所述液体培养基组成为葡萄糖15 25g/L，蛋白胨5 15g/L，酵母浸出粉8 15 g/L，磷酸铁O. 05、. 15 g/L，溶剂为人工海水，pH 6 7。所述人工海水每IOOml 组成为=NaCl 2. 448g, Na2SO4O. 3917g, KC10. 0664g,KBr O. 0096g, SrCl2O. 0024g, MgCl · 6H20 0. 4981g, CaCl2 · H2OO. 1102g, NaHCO3O. 0192g,H3BO3O. 0026g, NaF 0.0004g，蒸馏水 100ml。具体的，所述正丁醇提取物可按如下方法获得(I)将保藏的小红酵母Rhodotorula minuta 100101A菌株接种于斜面培养基,于25-35°C培养24-48 h，得到活化后的菌种；所述的斜面培养基组成为葡萄糖15 25g/L，蛋白胨5 15g/L，酵母浸出粉8 15 8/1，磷酸铁0.05、.15 g/L，琼脂15 25 g/L，溶剂为人工海水，pH 6 7 ；(2)将步骤(I)活化培养后的海洋真菌小红酵母Rhodotorula minuta 100101A菌体接种至液体种子培养基中，于25 35°C条件下培养16 48h，得到种子液；所述液体种子培养基组成为葡萄糖15 25g/L，蛋白胨5 15g/L，酵母粉8 15 g/L，磷酸铁0. 05、. 15 g/L,溶剂为人工海水，pH 6^7 ；(3)将步骤(2)种子液以19TlO%的体积比的接种量，移种到液体发酵培养基中，25 35°C、150-250r/min振荡条件下培养1Γ30天，得到发酵液；所述液体培养基组成为葡萄糖15 25g/L，蛋白胨5 15g/L，酵母粉8 15g/L，磷酸铁0. 05、. 15g/L，溶剂为人工海水，pH 6 7 ；(4)将步骤(3)的发酵液于4°C条件下细胞破碎，离心分离除去菌体，所得发酵液用正丁醇萃取后收集上层萃取液，旋蒸浓缩挥干制得的油状提取物总浸膏；(5)将步骤(4)的油状提取物总浸膏以甲醇水体积比为2 8^10 0的溶液为流动相(10:0时即全部为甲醇)，进行HP-20大孔树脂层析过柱，梯度洗脱，收集甲醇体积浓度80%以上的洗脱液，旋蒸浓缩挥干，即得所述正丁醇提取物。本发明的有益效果主要体现在提供了一株新的具有抗肿瘤活性的海洋真菌小红酵母(Rhodotorula minuta )100101A,对肿瘤细胞HepG2 (肝癌细胞)、PC_12 (神经癌细胞)均具有一定的细胞毒性，为新药筛选提供了基础。
图I为斜面培养基上海洋小红酵母10010IA的菌体形态；图2为光学显微镜(40倍)下海洋小红酵母100101A的菌体形态。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :海洋小红酵母菌株的分离纯化及菌种鉴定(I)菌株的分离纯化方法为将采集的海水运用稀释涂布法涂于马铃薯平板培养基上，多次平板划线至出现单菌落，挑取单菌落至新鲜马铃薯平板培养基上，28°C培养48h， 以菌株形态特征区别进行挑选，即得该菌株。(2)对筛选获得的菌株100101A进行18sRNA的PCR产物扩增，并与美国国立生物信息中心(NCBI)的基因库中的微生物18 s RNA核苷酸序列比对，将其命名为海洋小红酵母Rhodotorula minuta 100101A,提交中国典型培养物保藏中心,保藏号CCTCC No:M2012289，保藏日期2012年7月18日。实施例2 :海洋小红酵母的菌种活化及大量发酵培养(I)将实施例I中筛选获得的菌株接种于斜面培养基，于28°C培养48h，得到活化后的菌株，所述斜面培养基按如下组成配制葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，磷酸铁O. Ig,琼脂20g,人工海水1L，ρΗ6· O。(2)活化后的菌株接种于液体种子培养基中，液体种子培养基和发酵培养基配方相同葡萄糖20g，蛋白胨20gL，酵母粉10g，磷酸铁O. lg，人工海水1L，ρΗ6· O。(3)将海洋小红酵母菌株液体种子液以10%的体积比的接种量接种到大规模发酵培养基中，在28°C、200r/min摇床恒温培养14d后取出发酵液，在超声波细胞破碎仪中进行菌体破碎20min,然后于4°C条件8000r/min离心15min分离菌体与发酵液,得小红酵母发酵液。实施例3 :海洋小红酵母发酵液粗提物活性成分的提取小红酵母发酵液以等体积正丁醇萃取3次后旋蒸浓缩，得发酵液粗提物。粗提物经0. 45 μ m滤膜过滤除杂后过HP-20大孔树脂层析柱，以甲醇-水体积比分别为2:8，4:6，6: 4，8: 2，10:0五个极性段进行梯度洗脱，各极性段收集洗脱液，旋蒸浓缩挥干分别对应得到A、B、C、D、E共5段极性部位。实施例4 :发酵液粗提物活性成分的体外抗肿瘤实验具体步骤如下选取两株肿瘤细胞，分别为肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12细胞和人肝癌HepG2细胞，取对数期的细胞株制成细胞悬液，接种于96孔板中，培养48h，待测样品(5个极性部位A、B、C、D、E)加入0. P/oDMSOlO μ L溶解后，用无血清的1640细胞培养基稀释，力口100 μ L至试验组中，使得最终发酵液总浸膏的浓度分别为50 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml、400y g/ml、800y g/ml，5个极性部位A、B、C、D、E的浓度均为200 μ g/ml，阴性对照组加等量不含样品的无血清培养基，空白对照组则为无细胞和样品的无血清培养基，依托泊苷(VP-16)作为阳性对照品，每个浓度设5个复孔，肿瘤细胞在CO2培养箱(37°C)培养48h，每孔加入5mg/ml的MTT20 μ L，继续培养4h后，小心移去上清，每孔加DMSO150 μ L，振荡lOmin，用酶标仪充分振荡使得MTT紫色产物完全溶解，测490nm的A值，根据公式抑制率=(A阴性对照组-A空白对照组)-(A样品组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组)即可求得抑制率。经MTT (四甲基偶氮唑蓝)比色法体外抗肿瘤实验表明发酵液粗提物极性部位对肿瘤细胞H印G2、PC-12均具有一定的细胞毒性，其对PC-12和HepG2两种肿瘤细胞的抑制活性分别如下表所述表I :不同极性部位对PC-12的抑制活性
权利要求
1.一株海洋真菌-小红酵母(Rhodotorula minuta )100101A,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No M 2012289，保藏日期2012年7月18日。
2.如权利要求I所述的小红酵母100101A在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抗肿瘤药物为治疗神经癌或肝癌的药物。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述小红酵母100101A提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述提取物为正丁醇提取物，由如下方法获 得小红酵母100101A接种至液体发酵培养基，于25 35°C、15(T250r/min振荡条件下培养1Γ30天，得到发酵液，发酵液经细胞破碎，离心取滤液用正丁醇萃取，萃取液浓缩得浸膏，浸膏以甲醇水体积比为2 8^10 0为流动相，进行HP-20大孔树脂层析过柱，梯度洗脱，收集甲醇体积浓度80%以上的洗脱液，旋蒸浓缩挥干，即得所述正丁醇提取物；所述液体培养基组成为葡萄糖15 25g/L，蛋白胨5 15g/L，酵母浸出粉8 15 g/L，磷酸铁O. 05、. 15 g/L，溶剂为人工海水，pH 6 7。
全文摘要
本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的海洋真菌——小红酵母(Rhodotorula minuta)MNP100101A，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NoM2012289，保藏日期2012年7月18日。本发明的有益效果主要体现在提供了一株新的具有抗肿瘤活性的海洋真菌小红酵母(Rhodotorula minuta)MNP100101A，对肿瘤细胞HepG2(肝癌细胞)、PC-12(神经癌细胞)均具有一定的细胞毒性，为新药筛选提供了基础。
文档编号C12R1/645GK102925372SQ20121030684
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者王鸿, 吴一书, 谢燕瑾 申请人:浙江工业大学