专利名称：芽孢杆菌属溶藻菌的固体发酵与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于水环境污染生物治理领域，具体涉及芽孢杆菌属溶藻菌的固体发酵与应用。
背景技术：
水体富营养化是ー个全球性的、有着广泛影响的环境问题。在淡水中藻类短时间内大規模爆发的现象，称为“湖靛”(或称“水华”)，在海水中则称为“赤潮”。随着人类对自然环境的影响，水体富营养化程度越来越高，导致水体中微型浮游藻类大量繁殖，特别是高温季节情况更为严重。淡水中微囊蓝藻大量死后水体会缺氧恶臭且藻体释放毒素、使水生动物大量死亡，水体环境极度恶化，甚至人畜饮用后也会中毒或死亡；这将导致水体的观赏性与利用价值大大降低，给水产养殖业、供水系统和生态环境都造·成严重的影响。目前阻止藻类的大規模爆发，人们试行了很多的方法有物理法、化学法、生物法
坐坐寸寸ο溶藻细菌是ー类以直接或间接方式抑制藻类生长或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称。溶藻细菌对藻细胞作用的可能方式和机理主要有以下5种直接接触溶藻、释放杀藻物质、与藻竞争营养物、形成菌胶膜及进入藻细胞内杀灭藻细胞。已经发现的溶藻细菌有粘细菌，假单胞属、黄杆菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、节杆菌属以及欧文菌属、红球菌、蛭弧菌属、屈挠细菌属、腐生螺旋体属、弧菌、产气单胞菌等。可以发现溶藻菌大多数为G_菌，因G_菌多为水生生物的条件致病菌，故开发产品角度出发，本发明人最后选择最好是G+菌中的芽孢杆菌。芽孢杆菌属的特点
I.细菌呈直杆状，细胞染色大多数在幼龄培养时呈G+，好氧或兼性厌氧，化能异氧菌，具有发酵或呼吸代谢类型；在条件不利的情况下形成芽孢，将自已保护起来，复活率高。其有耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压等，故以其开发的产品有较高的稳定性。2.菌体生长营养要求简单。3.有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，对污染水体的有机物有较强的降解能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种芽孢杆菌属溶藻菌的固体发酵与应用，控制藻类生物量或阻止藻类大量増殖，达到水体环境的生态平衡。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
芽孢杆菌属溶藻菌的固体发酵与应用，其特征在干先将实验室保藏具有溶藻菌能的芽孢杆菌LDrzI、LDrz2菌株在NB或LB琼脂平板上进行提纯后，在30-37°C无菌条件下用用添加多糖(枸杞、香菇多糖)NB或LB液体培养基培养液体菌种；将液体菌种按3-10%接种到经过灭菌后冷却到30-40°C的固体培养基中在30-37°C条件下在发酵间内进行固体发酵；然后对固体发酵36-72h后的发酵料在60-70°C条件进行烘干，粉碎成50-60目细度的溶藻菌原粉；最后根据需要加入载体原料后制成单菌、复合菌溶藻菌产品或改性溶藻菌产品；根据水体的富营养化程度按该产品1-20PPM的使用量，用自然水体稀释后泼洒于富营养化静止/流水量小的富营养化水体发生初期，在l-5d内即可使蓝藻细胞“黄化”溶解以控制藻类生物量或阻止藻类大量増殖，使水体透明度増加，促进水体中的其它动、植物得以修复，最終达到水体环境的生态平衡。所述的用添加枸杞多糖NB液体培养基为10.0g/l蛋白胨+5.0g/l氯化钠+3g/l 牛肉膏+0. 1-0. 3g/l 枸杞多糖+1000ml 水，ΡΗ=7· 2-7. 4，在 120-125 °C 温度下灭菌25-30min,NB琼脂培养基是在NB培养基基础上加入15-20 g/Ι琼脂；所述的用添加香菇多糖LB液体培养基为:10. Og/1胰蛋白胨+10. Og/1氯化钠+5g/l酵母膏+0. 1-0. 3g/l香菇多糖+水1000ml，PH=7. 2-7. 5，在120_125°C温度下灭菌25_30min，LB琼脂培养基是在LB 培养基基础上加入15-20 g/Ι琼脂。所述的固体培养基以麦麸、豆柏和稻壳为原材料，其中，各原材料的质量比为麦麸豆柏稻壳=7-9 :0-2 :1-3，料与水的质量比为料冰=1 :0. 8-1. 5，
在120-125°C温度下灭菌30-60min，固体培养基的盛装容器可以是塑料袋、罐头瓶、发酵池、固体发酵反应器中的ー种。本发明具有如下优点
1、芽孢杆菌LDrzI、LDrz 2菌株是从自然水体与底泥中分离出的土著物种，安全，对环境不会造成生物侵危害；
2、芽孢杆菌属溶藻菌培养简单，可以利用价值低的农副产品为原料固体发酵，菌含量高，生产过程中对环境污染少；
3、芽孢杆菌属溶藻菌产品稳定性好，可根据需要生产出单菌株、复合菌株与复配出改性溶藻菌产品；
4、芽孢杆菌属溶藻菌除了能溶藻外，有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，对污染水体的有机物有较强的降解能力。
具体实施例方式下面通过具体实施例来进ー步说明，实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。实施例I
先将发明人从自然水体中分离出的具有溶藻菌能的芽孢杆菌LDrzI、LDrz2菌株在NB琼脂平板上进行提纯后，挑取LDrzl、LDrz2单个菌落，分别接种到NB液体培养基中于35°C无菌条件下培养液体菌种；接着将液体菌种按3%接种量分别接种到经过121°C灭菌40min灭菌后冷却到40°C的固体培养基，在30°C条件下在发酵间内进行固体发酵；然后对固体发酵72h后的发酵料在60°C条件进行烘干；粉碎成50目细度的溶藻菌原粉；最后加入菌粉100%重量的麦麸制成LDrzl、LDrz2单菌、LDrzl+LDrz2复合溶藻菌产品。该产品按5PPM用量用池塘水稀释后在傍晚时拨洒于静止(或流水量小)鱼虾池塘的富营养化水体发生初期，在3d内即可使蓝藻细胞黄化溶解从而控制藻类生物量或阻止藻类大量増殖，使水体透明度迅速増加，以促进水体中的其它动、植物得以修复，最終达到水体环境的生态平衡。其中，添加枸杞多糖的NB液体培养基为10. Og/Ι蛋白胨+5. Og/Ι氯化钠+3g/l牛肉膏+0. 2g/l枸杞多糖+IOOOml水，PH=7. 2，在121°C温度下灭菌30min，NB琼脂培养基是在NB培养基基础上加入15 g/Ι琼脂；固体培养基为麦麸豆柏稻壳=9 0 :1，料与水的质量比为料水=1 :0. 9，在121°C温度下灭菌50min，用耐高温的塑料袋装料。实施例2
先将发明人从自然水体中分离出的具有溶藻菌能的芽孢杆菌LDrzl、LDrz2菌株在LB琼脂平板上进行提纯后，分别挑取LDrZl、LDrZ2单个菌落接种到LB液体培养基中于35°C无菌条件下培养液体菌种；接着将液体菌种分别接8%接种量接种到经过121°C灭菌40min灭菌后冷却到40°C的固体培养基中在32°C条件下在发酵间内进行固体发酵；然后对固体发酵48h后的发酵料在70°C条件进行烘干；粉碎成50-60目细度的溶藻菌原粉；最后加入菌粉100%重量的麦麸和10%重量的r-PGA(生物絮凝剂)制成LDrzl、LDrz2单菌、LDrzl+LDrz2·复合菌改性溶藻菌产品(改性后的产品施于水体中后，r-PGA能促进藻类的絮凝，使藻类细胞聚集在一起，同时溶藻菌也释放ー些活性物质这样双重作用，使溶藻产品效果更明显)。该产品按IPPM用量用自然体稀释后泼洒于富营养化水体发生初期，在3d即可使蓝藻细胞黄化溶解后达到控制藻类生物量或阻止藻类大量増殖，使水体透明度増加，以促进水体中的其它动、植物得以修复，最終达到水体环境的生态平衡。其中，添加香菇多糖后的LB液体培养基为10.0g/l胰蛋白胨+10.0g/l氯化钠+5g/l酵母膏+0. 2g/l香菇多糖+水1000ml，PH=7. 4，在123°C温度下灭菌30min，LB琼脂培养基是在NB培养基基础上加入15 g/Ι琼脂；固体培养基为麦麸豆柏稻壳=8. 5 0. 5 1，料与水的质量比为料水=1 :1. 2，在122°C温度下灭菌50min，用罐头瓶装料。
权利要求
1.芽孢杆菌属溶藻菌的固体发酵与应用，其特征在于先将实验室保藏具有溶藻菌能的芽孢杆菌菌株进行提纯后，在30-37°C无菌条件下用添加多糖(枸杞、香菇多糖)后的NB或LB液体培养基培养液体菌种；将液体菌种按3-10%接种到经过灭菌后冷却到30-40°C的固体培养基中，在30-37°C条件下在发酵间内进行固体发酵；然后对固体发酵36-72h后的发酵料在60-70°C条件进行烘干，粉碎成50-60目细度的溶藻菌原粉；最后根据需要加入载体原料后制成芽孢杆菌单菌、复合菌溶藻菌产品或改性溶藻菌产品；根据水体的富营养化程度按该产品1-20PPM的使用量，用自然水体稀释后泼洒于富营养化静止/流水量小的富营养化水体发生初期，在l-5d内即可使蓝藻细胞“黄化”溶解以控制藻类生物量或阻止藻类大量増殖，使水体透明度増加，促进水体中的其它动、植物得以修复，最終达到水体环境的生态平衡。
2.根据权利要求2所述的芽孢杆菌属溶藻菌的固体发酵与应用，其特征在于所述的添加枸杞多糖后的NB液体培养基为10. Og/Ι蛋白胨+ 5. Og/Ι氯化钠+ 3g/l牛肉膏+O. 1-0. 3g/l 枸杞多糖 + IOOOml 水，PH=7. 2-7. 4，在 120_125°C温度下灭菌 25_30min，NB琼脂培养基是在NB培养基基础上加入15-20 g/Ι琼脂；所述的添加香菇多糖后LB液体培养基为10. Og/Ι胰蛋白胨+10. Og/Ι氯化钠+5g/l酵母膏+0. 1-0. 3g/l香菇多糖+水1000ml, PH=7. 2-7. 5，在120_125°C温度下灭菌25_30min，LB琼脂培养基是在NB培养基基础上加入15-20 g/Ι琼脂。
3.根据权利要求2所述的芽孢杆菌属溶藻菌的固体发酵与应用，其特征在于所述的固体培养基以麦麸、豆柏和稻壳为原材料，其中，各原材料的质量比为麦麸豆柏稻壳=7-9 :0-2 :1-3，料与水的质量比为料水=I :0.8-1.5, 在120-125°C温度下灭菌30-60min，固体培养基的盛装容器可以是塑料袋、罐头瓶、发酵池、固体发酵反应器中的ー种。
全文摘要
本发明公开了一种芽孢杆菌属溶藻菌的固体发酵与应用的方法。先将本公司实验室保藏具有溶藻菌能的芽孢杆菌LDrz1、LDrz2菌株进行提纯后在30-37℃无菌条件下培养液体菌种；接着将液体菌种接种到经过灭菌后的固体培养基中在30-37℃条件下在发酵间内进行固体发酵；然后对固体发酵36-48h后的发酵料在60-70℃条件进行烘干；粉碎成50-60目细度的溶藻菌原粉；最后根据需要加入载体原料后制成单菌、复合菌溶藻菌产品或改性溶藻菌产品。该产品使用于富营养化水体发生初期，在短期内即可控制藻类生物量或阻止藻类大量增殖，水体透明度迅速增加，以促进水体中的其它动、植物得以修复，最终达到水体环境的生态平衡，是水华生物防治的一个重要手段。
文档编号C12R1/07GK102839139SQ20121030812
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者朱杰, 周呈祥, 吴文坤 申请人:安徽联大生物环保科技有限公司