专利名称：新型狂犬病病毒疫苗ctn181株反向遗传系统的制作方法
技术领域：
本发明通过对原有狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统进行改造，构建新型的反向遗传系统，为研制安全、稳定、高效的新型狂犬病病毒疫苗奠定基础。
背景技术：
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus)引起的ー种急性、动物源性人兽共患传染病，病毒感染人或动物后，病死率几乎达100 %，是迄今为止人类病死率最高的急性传染病。据世界卫生组织(WHO)报告显示，全世界毎年因狂犬病死亡人数达55000人，其中99%发生于亚洲和非洲，仅亚洲每年大约死亡35000 40000人。目前，狂犬病尚无有效的治疗手段，接种疫苗仍是预防狂犬病唯一有效的方法。因此，在我国需要对犬进行大规模的免疫接种及加强对人暴露前和暴露后预防免疫，这是降低我国狂犬病的发病率的ー项 有效措施[參见俞永新.中国预防控制狂犬病降低发病率的思考[J].中国计划免疫，2007，13 (4):391-397.]。目前，狂犬疫苗主要以细胞培养疫苗和减毒活疫苗为主。由于人用狂犬疫苗价格和产量的原因，狂犬病的预防免疫需要的费用较高，而且往往需要多次接种，一般家庭难以承受。对于兽用疫苗，普遍应用的为减毒活疫苗，数量严重不足而且质量往往的不到保证，注射后还存在发生狂犬病的潜在危险，WHO狂犬病专家并不主张用减毒活疫苗注射免疫动物(參见WH0. Expert Committee on Rabies[M]. 1st report, Geneva: WHO. 2005. 931.) 因此，非常有必要研发ー种安全、稳定、高效和廉价的新型狂犬疫苗。CTN株狂犬病病毒的亲代病毒为1956年在山东省淄博市ー个感染狂犬病的病人脑组织中分离得到，经鼠脑和人二倍体细胞连续多次传代得到的减毒疫苗株，并于1983年和2005被世界卫生组织(WHO)批准作为中国狂犬病疫苗生产用毒株。基因序列分析表明，CTN株与我国各病毒株的核苷酸同源性为82% 93%，大于其他疫苗株与街毒代表株间的同源性，表明该疫苗能有效预防我国目前流行的狂犬病[參加盂胜利，徐葛林，明平刚，等.狂犬病毒疫苗株CTN-I八代次N和G基因序列測定及分析[J].中国人兽共患病学报，2007，23 (4) : 327-332.]。RNA病毒反向遗传技术的核心是构建RNA病毒的全长cDNA分子，在DNA水平上可对该cDNA可进行各种修饰或改造，通过体外转录过程可再次得到病毒RNA，将这些经改造的RNA转染细胞，即可获得改造后的新病毒。这项新技术为RNA病毒分子生物学研究开辟了新途径，也为新型疫苗的研发提供了有力的工具。近年来，狂犬病病毒的反向遗传学研究进展迅速，相继有六株狂犬病病毒株SAD B19, RC-HL, HEP-Flury, SHBRV, HNlO和CTN的感染性克隆构建成功，狂犬病病毒反向遗传体系构建策略不断完善，为研发新型的狂犬病减毒活疫苗奠定了基础。研究表明G蛋白是狂犬病病毒颗粒的表面膜蛋白，是诱发中和抗体的唯一抗原，对狂犬病病毒致病性和免疫原性起关键作用。G蛋白上的333位精氨酸或赖氨酸是狂犬病病毒致病决定因子，这个残基被选为产生减毒株的靶位点(參见=Tuffereau C，Leblois H，Benejean J，et al. Arginine or lysine in position 333 of ERA and CVSglygoprotein is necessary for rabies virulence in adult mice [J]. Virology, 1989,172(1):206-212.);而6蛋白中194位的天冬氨酸替换为丝氨酸可以增加狂犬病病毒的遗传稳定性(参见Faber M, Faber M L，Papaneri A，et al. A single amino acidchange in rabies virus glycoprotein increases virus spread and ennances viruspathogenicity[J]. J. Virol. 2005，79:14141 - 14148.)
发明内容
本发明的任务是提供ー种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统。本专利申请在已有的狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统(以下简称CTN181反向遗传系统)的達础上(參见Huang Y，Tang Q, bus an A, et al. Development of a reverse geneticssystem for a human rabies virus vaccine strain employed in China[J] . VirusRes，2010, 149 :28-35.),首先应用基因定点突变技术，分别对CTN反向遗传系统中G蛋白第194位和第333位氨基酸进行突变(194位天冬酰胺一丝氨酸；333位谷氨酰胺一谷氨酸)，将突变后的G蛋白基因替换CTN181反向遗传系统中的G蛋白基因；并对突变后的G蛋白基 因进行拷贝将其插入到CTN181反向遗传系统中G-L基因间的非编码区，分别构建含有两个和三个突变后G蛋白基因的全长感染性克隆(构建示意图见图7)，随后将其与辅助质粒一起转染BSR细胞，拯救出经改造的新型狂犬病病毒疫苗株。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统，是对狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统中G蛋白第194位和第333位氨基酸位点实施定点突变，使G蛋白第194位氨基酸由原来的天冬酰胺突变为丝氨酸，第333位氨基酸由原来的谷氨酰胺突变为谷氨酸。本发明提供的这种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统含有ー个、两个或/和三个突变后G蛋白基因的全长感染性克隆。利用本发明提供的这种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统，可拯救出经改造的新型狂犬病病毒疫苗株。本发明的另ー个任务是提供ー种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统的构建方法。本发明提供的新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统的构建方法，包括以下步骤步骤ー应用基因定点突变技术对狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统中的G蛋白基因进行突变，使G蛋白第194位氨基酸由原来的天冬酰胺突变为丝氨酸，第333位氨基酸由原来的谷氨酰胺突变为谷氨酸，具体方法是将要突变的G蛋白基因扩增后克隆到pGEM-T载体，利用以下引物m-Fl :5’ -TGTGATATTTTCACCM2AGCAGAGGGAAGAGA-3，m-Rl :5’ -TCTCTTCCCTCTGCTGCTGGTGAAAATATCACA-3’m-F2 :5， -TCACTACAAATCGGTCGAAACTTGGGATGAGAT-3，m-R2 :5’ - ATCTCATCCCAAGTTTCGACCGATTTGTAGTGA -3’对G蛋白基因中194位和333位的氨基酸位点进行定点突变，将突变后的G蛋白基因命名为GAS基因，将得到的突变后的重组质粒命名为pGEM-GAS ；
步骤ニ 利用以下引物分别扩增GAS基因G-Fl :5，-GAATTCTAGAACATGTCAACTATGG-3’ 与 G-R3 5’-GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3，；G-F4 :5’ -GCGCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3，与 G-R35，- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’ ；G-F2 5，-GCGATCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC-3，G-R25，-GGCGCGCCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3，；G-F3 :5，-GGCGCGCCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3，与 G-R3 :5，- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’ ；将PCR产物切胶回收后与pGEM-T载体进行连接，构建成重组质粒PGEM-GAS1、 PGEM-GAS2、PGEM-GAS3、pGEM_GAS4；步骤三人工合成含有BssH II、AsiS I、Asc I、Asc I酶切位点的linker并与PMD18-T载体连接，得到中间载体pMD-MCS ；步骤四利用内切酶BsiW I、Nhe I分别对pCTN_GFP和PGEM-GAS1进行双酶切，酶切产物切胶回收后进行连接构建成重组质粒PCTN-GAS。步骤五利用内切酶BsiW I、BssH II分别对pCTN_GFP和pGEM_GAS进行双酶切后连接构建pCTN-GAS-GFP ;随后，利用内切酶BssH II、Nhe I分别对pCTN-GAS_GFP和PGEM-GAS2进行双酶切后连接构建成重组质粒pCTN-GASGAS。步骤六利用内切酶Asc I ,Nhe I分别对pMD_MCS和pGEM_GAS4进行双酶切后连接构建重组质粒PMD-GAS4 ;随后，利用内切酶AsiS I ,Asc I双酶切pMD_GAS4和pGEM_GAS3后连接构建PMd-GAS3GAS4 ;将PMd-GAS3GAS4利用内切酶Asc I单酶切后切胶回收，再利用SI核酸酶处理去掉突出的碱基，经T4 DNA连接酶连接以去除Asc I酶切位点，处理后的PMd-GAS3GAS4与pCTN-GAS-GFP经BssH II、Nhe I双酶切后连接构建成重组质粒pCTN-GASGASGASo实验资料I材料与方法I. I细胞与质粒BSR 细胞与 MNA 细胞购于 ATCC ;pVAX_l 购于 Invitrogen 公司；pCTN-GFP为含有狂犬病病毒CTN181株全基因组的重组质粒，是将狂犬病病毒CTN181株全基因组按顺序分四段克隆在pVAX-1之中，同时将绿色荧光蛋白(GFP )基因插入到CTN181株G-L间隔区；辅助质粒pVAX-N、pVAX-P、pVAX-L是分别将CTN181株N、P和L基因插入到pVAX_l之中(具体方法參见Huang Y，Tang Q, Susan A, et al. Development of a reversegenetics system for a human rabies virus vaccine strain employed in China[J].VirusRes ， 2010,149 :28-35.)。pGEM-T 购于 Promega 公司；pMD18-T 购于 Takara 公司。I. 2其它试剂GoTaq Green Master Mix 购于 Promega 公司；
DH5a 感受态细胞、DL15000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、反转录酶 MMLV、dNTP mixture 购于 Takara 公司；Easy-A High Fidelity cloning enzyme 、 QuikChange Site-DiretedMutagenesis Kit 为 Stratagene 公司产品；各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶购于NEB公司；质粒小量与大量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购于Qiagen公司；Lipofectamine 2000 Reagent、TRIzol LS 购自 Invitrogen 公司；FITC标记的抗狂犬病病毒N蛋白抗体购自Millipore公司。I. 3实验方法 1.3.1引物设计实验中所用到引物序列及含有的酶切位点见表I。表I引物序列和所含有的酶切位点
引物名称引物序列<5’-3')备注
Primer namesPnmer sequencesRemarks
G-Fl5,-GAAIICTAGAACATGTCAACTATGG-3'EcoR I 酶切位点
G-RiS5-Gcgcgctttttttggacttg-S ,BssH Ii 酶切位点
m-Fl5，-TGTGATATTTTCACCAGCAGCAGAGGGAAGAGA-3 ’194突变位点
m-Rl5，-TCTCTTCCCTCTCCTCCTCGTGAAAATATCACA-3，194 突变位点
m-F25'-TCACTACAAATCGGTCGAAACTTGGGATGAGAT-3'333 突变位点
m-R25’- ATCTCATCCCAAGTTTCGACCGATTTGTAGTGA -3’333突变位点
MCS-Fl5 -GCGCGCAAAGCGATCGCAAGGCGCGCCAAAGCTAGCA -3'BssH II> AsiS I、Ase I、
MCS-Rl5 -GCTAGCTTTGGCGCGCCTTGCGATCGCTTTGCGCGCA -3，Nhe I 酶切位点
G-F2s^gcgatcgccttttaacatccctcaaaagac -3’AsiS I 酶切位点
G-R2s^ggcgcgcctttttttggacttgaaatatgaagg-s,Asc I 酶切位点
G-F35,-GGCGCGCCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3’Asc I 酶切位点
G-R35’- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3 ’Nhe I 酶切位点
G-F45,-GCGCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3’BssH II 酶切位点
nest-F5’-CGTACGATAAATCACTTCATTCGAG-3’鉴定引物
nest-R5; -TCCAGGC AC AAGCTTCCTC AAGGGA-35鉴定引物1.3.2 G蛋白基因的定点突变分析含有狂犬病病毒CTN181株全基因组pCTN-GFP质粒的序列，考虑到在全长质粒基础上进行定点突变，序列太长，突变难度大而且效率。所以，首先设计引物将要突变的G蛋白基因扩增后克隆到pGEM-T载体。按照QuikChange Site-Direted Mutagenesis Kit 的操作说明，利用引物 m_Fl、m_Rl 和 m_F2、m-R2对G蛋白基因中194位和333位的氨基酸进行定点突变，将突变后的G蛋白基因命名为GAS基因，突变后的重组质粒命名为pGEM-GAS。1.3.3中间载体pMD-MCS的构建与鉴定在构建含有多个GAS基因的过程中需要用到中间载体PMD18-T，并在中间载体中插入含有多个酶切位点的人工接头。首先人工合成含有BssH IKAsiS I、Asc I、Asc I酶切位点的linker，按照一定比例与pMD18_T载体连接。将连接产物转化感受态细胞DH5 a后，通过测序的方法鉴定重组质粒。I. 3. 4 连接 T 载体利用引物 G-Fl 与 G_R3、G_F4 与 G_R3、G_F2 与 G_R2、G_F3 与G-R3分别扩增GAS基因，将PCR产物切胶回收后与pGEM_T载体按照一定比例进行连接，构建重组质粒PGEM-GAS1、PGEM-GAS2、PGEM-GAS3、pGEM-GAS4，并通过PCR、双酶切和测序的方法对重组质粒进行鉴定。1.3.5重组质粒的构建与鉴定 (I)利用内切酶BsiW I、Nhe I分别对pCTN-GFP和PGEM-GAS1进行双酶切，酶切产物切胶回收后按照一定比例进行连接构建重组质粒pCTN-GAS ；(2)先利用内切酶BsiW I ,BssH II分别对pCTN-GFP和pGEM-GAS进行双酶切后连接构建pCTN-GAS-GFP。随后，利用内切酶BssH II、Nhe I 分别对pCTN-GAS-GFP 和 pGEM_GAS2
进行双酶切后连接构建重组质粒pCTN-GASGAS ；(3)先利用内切酶Asc I ,Nhe I分别对pMD_MCS和pGEM_GAS4进行双酶切后连接构建重组质粒PMD-GAS4。随后，利用内切酶AsiS I、Asc I双酶切pMD_GAS4和pGEM_GAS3后连接构建PMd-GAS3GAS4。实验中，发现Asc I识别位点中含有BssH II酶切位点，会对后续酶切产生影响。故先将PMd-GAS3GAS4利用内切酶Asc I单酶切后切胶回收，再利用SI核酸酶处理去掉突出的碱基，经T4 DNA连接酶连接以去除Asc I酶切位点。处理后的pMD_GAS3GAS4与pCTN-GAS-GFP经BssH II、Nhe I双酶切后连接构建重组质粒pCTN_GASGASGAS。各重组质粒都通过PCR、双酶切和测序的方法对进行鉴定，具体构建示意图见图7。1.3.6病毒的拯救将BSR细胞在6孔板中培养过夜，待其长成单层，细胞密度约为80% 90% (约4 6X105个细胞/孔)时用于转染。分别将1.5iig pCTN-GAS，pCTN-GASGAS, pCTN-GASGASGAS 与 0.75iig pVAX-N, 0. 375 u g pVAX-P,0. 375 u g pVAX-L 与适量的Lipofectamine 2000 Reagent混合后加入6孔板，置于37°C 5% C02培养箱培养6h后，更换新鲜配制的含10% FBS的DMEM培养液继续培养3天。将转染细胞及上清混合物反复冻融3次收获重组病毒。1.3.7 DFA鉴定重组病毒在96孔细胞培养板中加入100耵新鲜制备的BSR细胞悬液，然后加入50耵收获的重组病毒混合均匀，37°C 5% C02培养箱培养24h。去除细胞上清液，用PBS洗涤I次，加预冷的80%丙酮4°C固定30min。弃去丙酮，加入I :50稀释的FITC标记的抗狂犬病病毒N蛋白抗体和1:2000稀释的伊文思蓝，37 %孵育30min，PBS洗涤3次，加入60%甘油避光存放，在荧光显微镜下观察。1.3.8 RT-PCR鉴定重组病毒取250 感染重组病毒上清液加入750 ylTRIzol LS提取病毒RNA，以G-Fl引物为反转录引物合成cDNA，由G-Fl和G-Rl扩增病毒基因组中G蛋白的序列。同时，为了提高检测的准确性和灵敏度,再以nest-F和nest-R进行巢氏PCR扩增G蛋白中的部分序列。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具，也是我们改造/优化基因常用的手段。本研究中，我们利用体外定点突变技术对狂犬病病毒G蛋白上的两个关键位点进行改造。其中，333位的氨基酸是狂犬病病毒致病决定因子，这个残基被选为产生减毒株的靶位点；而将194位的天冬氨酸替换为丝氨酸，可以增加狂犬病病毒的遗传稳定性。研究中，我们选用的是Stratagene公司的QuikChange Site-directedMutagenesis kit,它通过设计ー对包含突变位点的引物(正、反向)和模板质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，延伸产物形成带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的,对DpnI敏感而被切碎(DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现)，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，通过筛选、测序鉴定我们得到了突变质粒的克隆。研究表明[參见MiloszF，Rojjanaporn P，Suchita S H，etal.Overexpression of the RaDies Virus (aiycoprotein Results in Ennancement 01Apoptosis and Antiviral Immune Response[J]. J. Virol. 2002, 76 (7):3374-3381.]提高狂犬病病毒G蛋白的表达量可以促进感染细胞的凋亡及增强机体的抗病毒免疫。因此，为了増加G蛋白在感染细胞中的表达水平和增强减毒活疫苗毒株的免疫原性，我们在反向遗传系统全长质粒病毒基因组中利用特定的酶切位点，将突变后的GAS基因替换原有的GFP基因，以构建含有两个GAS的全长质粒。同吋，为了构建含有三个GAS基因的全长质 粒，我们利用添加了含有合适酶切位点Linker的中间载体，将两个GAS基因串联到Linker中后再酶切下来插入原有质粒从而构建含有三个GAS基因的全长质粒。在拯救实验中，本研究将改造后分别含有ー个、两个和三个GAS基因全长感染性克隆和辅助质粒一起转染BSR细胞，采用DFA和RT-PCR的方法筛选重组病毒。我们在6孔细胞培养板中进行转染拯救重组病毒，经DFA检测中在部分细胞中可见发现散在绿色荧光，通过巢氏PCR检测可以扩增出预期的DNA片段，表明重组病毒拯救成功。总之，我们对狂犬病病毒疫苗株CTN181反向遗传系统进行了改造，拯救出了新型的重组病毒，为研制安全、稳定和高效的新型狂犬病病毒减毒活疫苗提供合格的疫苗候选株。
图I :突变体pGEM-GAS的鉴定。G蛋白基因定点突变结果突变后的质粒经测序发现，G蛋白基因成功的发生定点突变，638位碱基由A突变为G，1054位碱基由C突变为G，表明G蛋白基因已突变成功。图2 :重组质粒pCTN-GAS的鉴定。重组质粒pCTN_GAS鉴定結果重组质粒pCTN-GAS通过PCR和酶切鉴定可见1132bp条带，结果与预期一致，表明重组质粒pCTN-GAS构建成功。图3 :重组质粒pCTN-GASGAS的鉴定。重组质粒pCTN_GASGAS鉴定結果重组质粒pCTN-GAS-GFP通过PCR和酶切鉴定可见1132bp条带，结果与预期一致。重组质粒pCTN-GASGAS经酶切鉴定可见1657bp条带，结果与预期一致，表明重组质粒pCTN-GASGAS构建成功。图4 :重组质粒pCTN-GASGASGAS的鉴定。重组质粒pCTN_GASGASGAS鉴定结果重组质粒PMD-GAS4通过PCR、经双酶切鉴定可见1659bp条带。重组质粒pMD_GAS3GAS4经双酶切鉴定可见3320bp条带。重组质粒pCTN-GASGASGAS经双酶切鉴定，可见3320bp条带，结果与预期一致，表明重组质粒pCTN-GASGASGAS构建成功。图5 :重组病毒的DFA鉴定。重组病毒DFA鉴定结果拯救病毒感染BSR细胞后，经丙酮固定，荧光素标记抗狂犬病病毒N蛋白抗体染色，在荧光显微镜下均可见部分细胞胞浆内有散在荧光点而正常的BSR细胞不显示荧光，表明已拯救出重组病毒。图6 :重组病毒的RT-PCR鉴定。重组病毒的RT-PCR鉴定结果提取重组病毒RNA，以G-Fl为反转录引物合成cDNA。由G-Fl和G-Rl进行扩增，再以其PCR产物为模板，以nest-F和nest-R为引物进行巢氏PCR扩增出约500bp的条带，表明已拯救出重组病毒。图7 :含有突变后G蛋白基因的全长感染性克隆的构建示意图。
具体实施例方式实施例II材料与方法 I. I细胞与质粒BSR细胞与MNA细胞购于ATCC ;pVAX-l购于Invitrogen公司；pCTN-GFP为含有狂犬病病毒CTN181株全基因组的重组质粒，是将狂犬病病毒CTN181株全基因组按顺序分四段克隆在PVAX-I之中，同时将绿色荧光蛋白(GFP )基因插入到CTN181株G-L间隔区；辅助质粒pVAX-N、pVAX-P, pVAX-L是分别将CTN181株N、P和L基因插入到 pVAX-1 之中(具体方法參见Huang Y，Tang Q, Susan A, et al. Development ofa reverse genetics system for a human rabies virus vaccine strain employed inChina [J] . VirusRes，2010,149 :28-35.) ;pGEM_T 购于 Promega 公司；pMD18_T 购于Takara 公司。I. 2 其它试剂 GoTaq Green Master Mix 购于 Promega 公司；DH5 a 感受态细胞、DL15000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、反转录酶MMLV、dNTP mixture购于Takara公 ロJ ；Easy-A High Fidelity cloning enzyme > QuiKChange Site-Direted MutagenesisKit为Stratagene公司产品；各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶购于NEB公司；质粒小量与大量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购于Qiagen公司；Lipofectamine 2000 Reagent、TRIzol LS购自Invitrogen公司；FITC标记的抗狂犬病病毒N蛋白抗体购自Millipore公司。I. 3实验方法1.3.1引物设计实验中所用到引物序列及含有的酶切位点见表I。表I引物序列和所含有的酶切位点
权利要求
1.一种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统，其特征在于，该反向遗传系统是对狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统中G蛋白第194位和第333位氨基酸位点实施了定点突变，使G蛋白第194位氨基酸由原来的天冬酰胺突变为丝氨酸，第333位氨基酸由原来的谷氨酰胺突变为谷氨酸。
2.根据权利要求I所述的新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统，其特征在于，含有一个、两个或/和三个突变后G蛋白基因的全长感染性克隆。
3.权利要求I或2所述的新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统在拯救狂犬病病毒疫苗株中的应用。
4.一种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统的构建方法，包括以下步骤 步骤一应用基因定点突变技术对狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统中的G蛋白基因进行突变，使G蛋白第194位氨基酸由原来的天冬酰胺突变为丝氨酸，第333位氨基酸由原来的谷氨酰胺突变为谷氨酸，具体方法是将要突变的G蛋白基因扩增后克隆到pGEM-T载体，利用以下引物m-Fl :5’ -TGTGATATTTTCACCMSAGCAGAGGGAAGAGA-3，m-Rl :5’ -TCTCTTCCCTCTGCTGCTGGTGAAAATATCACA-3’m-F2 :5， -TCACTACAAATCGGTCGAAACTTGGGATGAGAT-3，m-R2 :5’ - ATCTCATCCCAAGTTTCGACCGATTTGTAGTGA -3’ 对G蛋白基因中194位和333位的氨基酸位点进行定点突变，将突变后的G蛋白基因命名为GAS基因，将得到的突变后的重组质粒命名为pGEM-GAS ； 步骤二 利用以下引物分别扩增GAS基因G-Fl5，-GAATTCTAGAACATGTCAACTATGG-3，与 G-R3 ^y-GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3，；G-F4 :5’ -GCGCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3’ 与 G-R35’ - GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3，；G-F2 :5’-GCGATCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC-3，G-R25，-GGCGCGCCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3，；G-F3 :5，-GGCGCGCCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3，与 G-R3 :5，- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3，； 将PCR产物切胶回收后与pGEM-T载体进行连接，构建成重组质粒pGEM-GASpPGEM-GAS2、PGEM-GAS3、pGEM_GAS4； 步骤三:人工合成含有BssH II、AsiS I、Asc I、Asc I酶切位点的linker并与pMD18_T载体连接，得到中间载体pMD-MCS ； 步骤四利用内切酶BsiW I、Nhe I分别对pCTN-GFP和PGEM-GAS1进行双酶切，酶切产物切胶回收后进行连接构建成重组质粒PCTN-GAS。
步骤五利用内切酶BsiW I ,BssH II分别对pCTN-GFP和pGEM-GAS进行双酶切后连接构建 pCTN-GAS-GFP ;随后，利用内切酶 BssH II、Nhe I 分别对 pCTN_GAS_GFP 和 pGEM_GAS2进行双酶切后连接构建成重组质粒pCTN-GASGAS。
步骤六利用内切酶Asc I、Nhe I分别对pMD-MCS和pGEM_GAS4进行双酶切后连接构建重组质粒PMD-GAS4 ;随后，利用内切酶AsiS I、Asc I双酶切pMD_GAS4和pGEM_GAS3后连接构建PMd-GAS3GAS4 ;将PMd-GAS3GAS4利用内切酶Asc I单酶切后切胶回收，再利用SI核酸酶处理去掉突出的碱基，经T4 DNA连接酶连接以去除Asc I酶切位点，处理 后的PMd-GAS3GAS4与pCTN-GAS-GFP经BssH II、Nhe I双酶切后连接构建成重组质粒pCTN-GASGASGASo
全文摘要
本发明提供了一种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统，首先采用基因定点突变技术分别对狂犬病病毒CTN 株G蛋白194位和333位氨基酸进行定点突变，将突变后的G蛋白基因替换原有反向遗传系统中的G蛋白基因，同时对突变后的G蛋白基因进行拷贝，构建含有两个和三个改造后G蛋白基因的全长感染性克隆，并将其分别与辅助质粒共转染BSR细胞，拯救出了分别含有一个、两个和三个突变后G 蛋白基因的重组狂犬病病毒，为研制安全、稳定、高效的新型狂犬病病毒疫苗奠定了基础。
文档编号C12N15/47GK102796753SQ20121031020
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月17日
发明者解庭波, 明平刚, 唐芳, 黄思佳, 徐葛林, 严家新 申请人:武汉生物制品研究所有限责任公司