专利名称：适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基及方法
技术领域：
本发明涉及细胞工程技术领域，特别是涉及ー种用于支持Vero细胞贴壁生长和支持病毒増殖的培养基和使用方法，更具体地说是用于VeiO细胞微载体悬浮培养及微载体悬浮规模放大培养的培养基及利用该养基实现规模化培养的方法。
背景技术：
Vero细胞来源清晰，历史清楚，一定代次内无致瘤性，是世界卫生组织(WHO)和我国生物制品规程批准可用于人类和兽类疫苗生产的细胞系，是现阶段病毒疫苗生产最主要的细胞基质。Vero细胞对多种病毒敏感，且病毒増殖滴度高。目前国内各种以Vero细 胞为生产介质的生物制品产业蓬勃发展，越来越多的企业已达到了商业化生产的要求，这就需要大量可供生产用的细胞培养基，同时也亟需一定规模的体外培养。然而，大多数传统培养基需要添加10%左右的牛血清，血清购买和储存的成本高，更重要的是，添加高浓度的血清大大增加了下游产品纯化的压力。血清组分的复杂性及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，増加了产品生产的不稳定性和产品质量控制的难度。不可否认，使用无血清培养基是避免以上风险的较好途径，国外也已有多种商品化的Vero细胞无血清培养基上市，如JRH公司的EX-CELLTMVERO，Invitrogen公司的VP-SFM和OptiPro SFM等。但无血清培养基售价高，供货期长，对企业来说增加了大量成本，降低了其市场竞争力；另外，细胞由含血清培养基转入无血清培养基存在适应过程，需要根据细胞株的特性尝试不同的无血清培养基产品，细胞无血清适应需要4 5代的时间，一般情况下细胞在无血清培养基中培养8代后，生长会变慢。无血清细胞库的建立也是ー个难题。当涉及反应器微载体系统的规模放大，采用无血清培养基的生产路线将面临更大的问题。贴壁依赖型细胞的放大需要胰蛋白酶的消化，去除了血清，如何中和培养基中的胰蛋白酶是技术人员要迫切解决的。现在常用的方法是添加植物来源的胰蛋白酶抑制剂，如大豆胰蛋白酶抑制剂。但是，胰蛋白酶抑制剂容易失活，储存条件苛刻；更重要的是大量使用胰蛋白酶抑制剂成本上是不允许的。另外，长时间使用胰酶抑制剂会抑制细胞的生长。降低细胞生长阶段的血清添加量，优选的将血清浓度降至痕量(1% (v/v)以下)应该是可行的方法。本发明通过提供一种低成本细胞培养基解决了现有的技术问题。即Vero细胞生长阶段添加痕量血清，可支持Vero在方瓶、滚瓶上生长，并可支持Vero细胞微载体悬浮培养和微载体悬浮规模放大培养。另外本培养基可以作为病毒维持液，实现病毒无血清生产。基于微载体细胞培养生产疫苗的エ艺规模已达到1000L以上[1-5]。反应器放大到下一级反应器的基本转移模式有消化转移和球转球。球转球是指微载体上的细胞汇合成单层后，按ー定比例加入新的微载体，并采取某些措施(如低转速搅拌、间歇搅拌等)促使细胞从旧微载体向新微载体迁移而实现放大。球转球放大过程可以直接在原反应器中添加新微载体，使微载体浓度増大；也可以将长有细胞的旧球打入下一级反应器中，加入新微载体后用新鲜培养基稀释微载体至原来浓度。虽然已有学者报道了球转球放大的成功案例[6]，但要求细胞的迁移能力强，而且旧球上的细胞容易长得过老，因此限制了其广泛应用。消化转移是指用胰蛋白酶将细胞从微载体上消化下来，并把细胞或者细胞和微载体接入下一级反应器中，补加新微载体和新鲜培养基后开始新ー轮的微载体细胞培养。从操作层面上讲只要在两级反应器之间加入消化反应器，消化转移适用于绝大多数微载体放大工艺。然而越来越多的学者在实践中发现微载体培养的系列传代是十分复杂的，随着传代数増加，细胞在微载体上的生长速率急剧下降。Van等报道了ー种猴肾细胞在微载体上传代时细胞最高密度逐渐下降，传至第六代或第七代时细胞停止増殖[7]。Hu等也报道了相似的现象，他们用胰蛋白酶将FS-4细胞从微载体上成功消化下来并接种到新的微载体上，结果发现细胞在第一代时倍增了 2. 2倍，而在第三代只倍増I. 5倍[8]。传代过程中不能维持稳定的细胞增埴速度已成为微载体应用于大规模细胞培养的一大障碍。国内广泛采用两阶段法生产生物制品细胞生长阶段用MEM、M199等基础培养基添加10% NBCS，待细胞汇合成单层，经PBS洗涤去除血清；生产阶段用基础培养基添加适量白蛋白或者少量血清作为细胞維持液，用于产品的生产。首先，由于在细胞生长阶段添加了大量血清，用PBS洗涤时可能会有过量的血清残留而造成产品不合格，尤其在大規模生产过程中对上千升培养体系的洗涤是非常繁琐和困难的。其次，血清批间差异很大是造成生物制品批次间差异的重要因素，10% NBCS的添加无疑大大增加了批次间的不稳定。再次，生产阶段去除或大幅度降低血清浓度后，很难长时间保持良好的细胞状态，从而显著影响产品的产量和质量。完全无血清生产自行开发或者直接购买商业化无血清培养基，从细胞生长到产品生产都使用无血清培养基。
首先，无血清培养基开发难度大，开发费用高。其次，商业化无血清培养基售价高，供货期长，细胞株普适性较差。再次，贴壁细胞需要胰蛋白酶消化才能传代，失去了血清的中和作用，胰蛋白酶会对细胞造成伤害，使用胰酶抑制剂(植物多肽)可以抑制胰酶的活性，但是胰酶抑制剂本身对细胞有一定的毒害作用，很难实现微载体系统培养规模的放大。大多数常规细胞培养基的起点是ー种基本的基础培养基，一般包含氨基酸、糖类、维生素、无机盐、微量元素、缓冲液。对大多数常规的培养基而言，将适当的动物血清或者血清白蛋白以及脂质成分加入到该基本的基础培养基中而制得用于支持细胞生长和繁殖、重组蛋白表达以及病毒复制或病毒产物表达所必需的完全培养基。考虑到血清的安全和批次间稳定性问题，在现有技术中在用其他蛋白替换物替换血清成分方面已经做了ー些尝试。例如，中国专利200710187466公布了ー种无血清培养基，它由I)常规的基础培养基，2)脂类混合物，3)重组蛋白和生长因子组成，其中添加了脂溶性维生素、转铁蛋白、胰岛素、表皮生长因子、前列腺素、三碘甲状腺激素等重组蛋白、多肽和激素。虽然在该培养基中可以实现VeiO细胞单细胞悬浮培养，但是最大细胞密度仅仅达到2. I X 106细胞数/毫升，与基础培养基添加10%牛血清贴壁培养时细胞密度一致，说明完全无血清悬浮培养不能很好的支持细胞生长。尽管实现了 Vero细胞无血清培养，但是其中添加成分非常昂贵，大大増加了培养基成本，远远超过基础培养基添加10%牛血清的成本，不能支持细胞的生长至足够高的水平以用于经济的生产。因此，在培养基的性能和总成本两方面仍需要改进。说明现阶段完全摒弃血清不能够获得良好的Ver0细胞培养效果。中国专利201110231805. 3描述了 Vero细胞无血清微载体悬浮培养方法，其使用的培养基为商业化培养基。虽然实现了 Vero细胞无血清微载体悬浮培养，但是仅仅实现了5升总体积生物反应器培养，没有涉及放大培养，并且在2克/升cytodexl微载体其仅仅实现了最大细胞密度I. 2X106细胞数/毫升。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供ー种适用于VeiO细胞微载体悬浮放大培养的培养基及方法，能够不仅适合在添加痕量血清情况下Veix)方瓶静置培养和滚瓶培养，也支持微载体悬浮培养和反应器微载体放大培养，还可以作为无血清病毒維持液实现无血清病 毒生产。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是提供ー种适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基，其特征在于包括氨基酸，无机盐，维生素，蛋白水解物，脂类，缓冲成分和添加物(请给出几种物质的配比比例或者整体比例范围)。优选的是，所述氨基酸的含量以毫克/升计为L-色氨酸5~60
L-半胱氨酸5 ~ 72
L-异亮氨酸27 ~ 175
し亮氨酸30 ~ 200
L-缬氨酸20 ~ 200
L-精氨酸盐酸盐48 415
L-组氨酸盐酸盐20~98 L-赖氨酸30 ~ 215
L-蛋氨酸22 ~ 115
L-谷氨酸4~30
L-苯丙氨酸25 ~ 196
L-天冬酰胺47 ~ 600
甘氨酸3~40
L-脯氨酸17.25 ~ 150
L-丙氨酸3~45
L-天冬氨酸3 ~ 70.5
し丝氨酸27 ~ 270
し苏氨酸50 ~ 300
し谷氨酰胺365 一 584
L-胱氨酸盐酸盐32~64
し酪氨酸ニ钠盐56 ~ 100。
优选的是，所述维生素的含量以毫克/升计为
维生素C0.1 ~ 15
磷酸吡哆醇0.2 ~ 2
磷酸P比哆醛0.001 ~ 0.1
钻铵素0.03 ~ 3
烟酰胺0.1-5
核黄素0.1 ~ 0.8
盐酸疏胺素0.2 ~ 5
氯化胆碱I ~ 8
D-泛酸钙0.1-4
叶酸0.1 ~ 4
生物素0.003 ~ 0.1
肌醇2~10。优选的是，所述无机盐的含量以毫克/升计为
六水氯化镁I ~ 60无水硫酸镁1~60
无水氯化钙5 ~ 160
氯化钟50 400
氣化钠5000 ~ 7000
づK嶙酸ニ氢钠40-200
磷酸氢ニ钠10 ~ 180
七水合硫酸锌O.卜0.5
九水合硝酸铁0.01 ~ 0.5
亚硒酸钠0.001 ~ 0.02
五水疏酸铜0.0001 ~ 0.002。优选的是，所述水解物含量以毫克/升计为大豆水解物500 6000优选的是，所述脂类的含量以毫克/升计为亚油酸O. 01 O. I嵌段式聚醚F68 500 1000。优选的是，所述缓冲剂的含量以毫克/升计为碳酸氢钠2400 28OO羟こ基哌嗪こ磺酸2000 3800。
优选的是，所述添加物的含量以毫克/升计为
D-葡萄糖1000 ~ 5000
丙酮酸钠30-165
还原型谷耽甘肽 0.01 ~ 0.9次黄嘌呤納盐0.1 ~ 5
腐胺0.08 ~ 0.4
硫辛酸0.1 ~ 0.4
重组人表皮生长因子0.00卜0.01。优选的是，所述培养基也可含有其他水溶性成分，包括胰岛素，用于可以加强糖类的吸收；运铁蛋白，用于转运铁；痕量元素如硒，作为过氧化反应保护剂；こ醇胺，作为脂质前体；类固醇激素如睾丸素；甲状腺激素如三碘甲腺原氨酸；核酸前体如次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷、脱氧腺苷和脱氧胞苷，以及在常规的用于细胞培养的补充了血清的培养基或无血清培养基中含有的其他营养成分。一种用于VeiO细胞生物反应器微载体培养并实现多种方式的生物反应器放大工艺，使用适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基在T-25组织培养瓶中贴壁培养Vero细胞，将在T-25组织培养瓶中用含10% (v/v)新生牛血清的MEM培养基培养的Vero细胞用O. 25% (w/v)的胰蛋白酶消化8分钟；分别用下列表I所列的含1% (v/v)新生牛血清的低血清培养基和含10% (v/v)新生牛血清的MEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为2. 5 X IO5细胞数/毫升。按5ml/瓶接种于T-25组织培养瓶，37°C、5%C02静止培养，用倒置显微镜观察细胞形态并拍照记录。培养72小时后，VeiO细胞在本发明含1% (v/v)新生牛血清的低血清培养基和含10% (v/V)新生牛血清的MEM培养基中汇合成单细胞层；表I
权利要求
1.一种适用于VeiX)细胞微载体悬浮放大培养的培养基，其特征在于包括氨基酸，无机盐，维生素，蛋白水解物，脂类，缓冲成分和添加物。
2.根据权利要求I所述的适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基，其特征在于所述氨基酸的含量以毫克/升计为L-色氨酸5~60 L-半胱氨酸5 ~ 72 L-异亮氨酸27~175 L-亮氨酸30 ~ 200 L-缬氨酸20 ~ 200 L-精氨酸盐酸盐48 ~ 415 L-组氨酸盐酸盐20~98 L-赖氨酸30 ~ 215 L-蛋氨酸22-115 L-谷氨酸4 ~ 30 L-苯丙氨酸25 ~ 196 L-天冬酰胺47 ~ 600 甘氨酸3~40 L-脯氨酸17.25 ~ 150L-丙氨酸3~45L-天冬氨酸3 ~ 70.5 L-丝氨酸27 ~ 270し苏氨酸50 ~ 300L-谷氨酰胺365 ~ 584L-胱氨酸盐酸盐32 ~ 64L-酪氨酸ニ钠盐56 ~ 100。
3.根据权利要求I所述的适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基，其特征在于所述维生素的含量以毫克/升计为维生素C0.1 ~ 15磷酸P比哆醇0.2 ~ 2磷酸吡哆醛0.00卜0.1钴铵素0.03 ~ 3烟酰胺0.1-5核黄素0.1 ~ 0.8盐酸疏胺素0.2 ~ 5氯化胆碱I ~ 8D-泛酸約0.1-4叶酸0.1 ~ 4生物素0.003 ~ 0.1肌醇2~10。
4.根据权利要求I所述的适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基，其特征在于所述无机盐的含量以毫克/升计为六水氯化镁I ~ 60无水疏酸镁1~60无水氯化钙5 ~ 160氯化钾50 ~ 400氯化钠5000 ~ 7000一水鱗酸ニ氢钠40 ~ 200磚酸氢ニ钠10-180七水合硫酸锌0.1 ~0.5九水合硝酸铁0.01 ~ 0.5亚硒酸納0.001 ~ 0.02五水硫酸铜0.0001 ~ 0.002。
5.根据权利要求I所述的适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基，其特征在于所述水解物含量以毫克/升计为大豆水解物500 6000。
6.根据权利要求I所述的适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基,其特征在于所述脂类的含量以毫克/升计为亚油酸O. 01 O. I嵌段式聚醚F68 500 1000。
7.根据权利要求I所述的适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基，其特征在于所述缓冲剂的含量以毫克/升计为碳酸氢钠2400 2800羟こ基哌嗪こ磺酸2000 3800。
8.根据权利要求I所述的适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基，其特征在于所述添加物的含量以毫克/升计为D-葡萄糖1000 ~ 5000丙酮酸納30-165还原型谷胱甘肽 0.01 ~ 0.9次黄嘌呤钠盐0.1-5腐胺0.08 ~ 0.4硫辛酸0.1 ~ 0.4重组人表皮生长因子0.001 ~0.01。
9.根据权利要求I所述的适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基，其特征在于所述培养基也可含有其他水溶性成分，包括胰岛素，用于可以加强糖类的吸收；运铁蛋白，用于转运铁；痕量元素如硒，作为过氧化反应保护剂；こ醇胺，作为脂质前体；类固醇激素如睾丸素；甲状腺激素如三碘甲腺原氨酸；核酸前体如次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷、脱氧腺苷和脱氧胞苷，以及在常规的用于细胞培养的补充了血清的培养基或无血清培养基中含有的其他营养成分。
10.一种用于VeiX)细胞生物反应器微载体培养并实现多种方式的生物反应器放大工艺，其特征在于使用适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基在T-25组织培养瓶中贴壁培养Vero细胞，将在T-25组织培养瓶中用含10% (v/v)新生牛血清的MEM培养基培养的Vero细胞用O. 25% (w/v)的胰蛋白酶消化8分钟；分别用下列表I所列的含1% (v/v)新生牛血清的低血清培养基和含10% (v/v)新生牛血清的MEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为2. 5X IO5细胞数/毫升。按5毫升/瓶接种于T-25组织培养瓶，37°C、5% CO2静置培养，用倒置显微镜观察细胞形态并拍照记录。培养72小时后，VeiO细胞在本发明含I % (v/v)新生牛血清的低血清培养基和含10 % (v/v)新生牛血清的MEM培养基中汇合成单细胞层；表I__
11.一种用于VeiO细胞生物反应器微载体培养并实现多种方式的生物反应器放大工艺，其特征在于还包括微载体系统5升生物反应器消化放大培养至25升生物反应器，在5升反应器中微载体悬浮培养Veix)细胞，培养至72小时，微载体上的细胞用胰蛋白酶消化，补加新微载体，将消化下来的细胞和微载体混匀后打入25升生物反应器内培养，工作体积为18升；25升反应器反应器參数设置温度为37°C、p小时值为7. 2、溶氧为40%饱和空气、搅拌速度为35转/分钟；经过一次消化放大操作，Vero细胞在25升反应器中生长正常，培养96小时细胞可形成致密单层，培养144小时时细胞密度达到6. 5 X IO6升升升细胞数/毫升，最高密度的降低可能是消化转移操作中微载体(微载体总量降低)损耗造成。
12.根据权利要求11所述的用于VeiO细胞生物反应器微载体培养并实现多种方式的生物反应器放大工艺，其特征在于还包括微载体系统25升生物反应器球转球エ艺，在5升反应器中微载体悬浮培养Veix)细胞，培养至60小时，细胞即将长成单层，以新老微载体比例3 I向培养基中加入新微载体，与长满细胞的老微载体混合，培养体积不变；初期进行间歇搅拌30分钟搅拌3分钟，搅拌转速为30转/分钟，培养6小时，取样观察细胞的贴附情况，后续进行连续搅拌；连续搅拌时的反应器參数设置温度为37°C、pH值为7. 2、溶氧为40%饱和空气、搅拌速度为60转/分钟；Veix)细胞可从新微载体迁移至老微载体，将5升反应器中培养物转移到25升生物反应器中并补加培养液至11升，整个培养过程持续200小时，最高细胞密度达到6. 5X IO6升升细胞数/毫升。
13.—种无血清培养基，其特征在于包括氨基酸、无机盐、维生素、糖类等，其中加入了蛋白水解物成分、脂质成分和保护成分，这些物质一起提供了支持细胞生命、生长和繁殖所必需的基本营养成分。
14.根据权利要求13所述的ー种无血清培养基，其特征在于所述还包含蛋白水解物成分，该蛋白水解物不仅补偿了培养基中氨基酸的含量，还提供了对血清或白蛋白的替代物。
15.根据权利要求14所述的ー种无血清培养基，其特征在于所述蛋白水解物是商业上可获得的，包括水解乳白蛋白，大豆水解物，酪蛋白水解物，胰蛋白胨磷酸肉汤和植物水解物中的任ー种。
全文摘要
本发明公开了一种造用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基，包括氨基酸，无机盐，维生素，蛋白水解物，脂类，缓冲成分和添加物。通过上述方式，本发明能够不仅适合在添加痕量血清情况下Vero方瓶静置培养和滚瓶培养，也支持微载体悬浮培养和反应器微载体放大培养，还可以作为无血清病毒维持液实现无血清病毒生产。
文档编号C12N5/071GK102827804SQ20121031336
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者张大鹤, 滕小锘, 龚迪 申请人:苏州市沃美生物技术有限公司