专利名称：靶向抑制羊痘病毒ORF095基因的序列siRNA-296的制作方法
技术领域：
本发明涉及四个靶向抑制羊痘病毒0RF095基因的siRNA序列，以及这些序列的用途。
背景技术：
羊痘(Capripox，CP)包括绵羊痘、山羊痘和牛的皮肤疙瘩病，其中前两者是由绵羊痘病毒(Sheeppox virus, SPPV)和山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)分别引起绵羊和山羊发生的接触性传染病。病畜体温升高，全身出现丘疹或结节、水疱、内脏病变甚至死亡，给世界养羊业造成了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其规定为法定必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。羊痘的预防和控制一直是研究的热点。0RF095是编码病毒粒子包装核心蛋白基因，与猴痘病毒(Monkeypox virus,MYXV)的 M093L 基因(accession no. AF170726)，以及牛痘病毒(vaccinia virus, VACV) A4L(accession no. M35027)同源。0RF095编码39 kDa的酸性蛋白质，是病毒粒子包装核心蛋白基因在病毒粒子感染后的包装和解离过程中合成的主要蛋白质。因此，选择0RF095基因作为RNA干扰的靶标，将会使病毒复制过程中断，从而达到抑制病毒增值的作用。但目前世界上很少有基于RNA干扰技术靶向羊痘病毒的研究的报道，也没有RNA干扰方法在0RF095蛋白的研究的报道。与类似方法靶向其他基因实验结果相比发现，0RF095基因作为RNA干扰靶向的目的基因，以本发明设计合成的序列来抑制羊痘病毒复制是一个更为理想的选择。
发明内容
本发明提供四个人工序列，在相关的实验中这些序列分别表现出对羊痘病毒0RF095基因具有抑制作用。本发明的四个人工序列分别为
基因序列 siRNA-61 为GTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGACT TGAGGCTGTTGTCATACTT(SEQ. NO. l)o基因序列siRNA-70为
GCTTCTACTTCAAGTTTAATTTCAAGAGAATTAAACTTGAAGTAGAA GCTT (SEQ. NO. 2)。基因序列siRNA-165 为
GATGAATCAATTGGAAGA AAATCAAGAGACTTTTACTAGTCATCATGGCTT (SEQ. NO. 3)
基因序列siRNA-296为
GCCATGATGAACTAGTAAAAGTTCAAGAGACTTTTACTAGT TCATCATGGCTT (SEQ. NO. 4)。相关的实验表明，本发明的序列siRNA-61、siRNA-70、siRNA_165和siRNA-296均可以抑制羊痘病毒0RF095基因的表达。相关的实验提示本发明的序列siRNA-61、siRNA-70、siRNA-165和siRNA-296可在制备抗羊痘病毒的疫苗中的应用，也可在制备抗羊痘病毒的药物中的应用。
更进一步，本发明的序列SiRNA-61、SiRNA-70、siRNA-165 和 siRNA-296 可在培育具有抗羊痘病毒的羊品种中应用。例如敲除相关的基因以培育对羊痘病毒具有自然抵抗能力的羊的新品种。
图I为载体pEGFP-Nl转染细胞48小时后的表达情况的荧光显微照片，由图可见，通过荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白表达量很高。图2为载体pEGFP-Nl转染细胞48小时后流式细胞仪检测图，由图可见绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为35. 56%。图3为转染在荧光显微镜采用绿色荧光暗场下的表达情况，此图可看出PEGFP-0RF095在BHK-21细胞中得到了表达，并且通过荧光显微镜观察到0 RF095与绿色荧光蛋白融合表达较高。图4为pEGFP-0RF095转染到细胞48小时后流式细胞仪检测图，有图可见绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为14. 78%。图5为共转染pEGFP-0RF095和对照siRNA_C到细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图。其中左图通过荧光显微镜观察到0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量比转染了 siRNA-61，siRNA-70, siRNA-165 和 siRNA-296 组多。图6共转染pEGFP-0RF095和对照siRNA_C到细胞48小时后流式细胞仪检测检测图，由图可见绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为14. 65%，表达绿色荧光蛋白的细胞阳性细胞率与图4相当。图7共转染pEGFP-0RF095和siRNA-61到细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图。通过荧光显微镜观察到0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量明显比没有转染siRNA-61组而仅转染pEGFP-0RF095组少。图8为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-61到细胞48小时后的表达情况流式细胞仪检测图，右图可见流式细胞仪检测到绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为I. 34%，与siRNA对照组相比，转染siRNA-61组的0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量下降了 90. 9%。图9为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-70到细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图。由图可见通过荧光显微镜观察到0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量远比仅转染 PEGFP-0RF095 组少。图10为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-70到细胞48小时后的表达情况流式细胞仪检测图。由图可见流式细胞仪检测到绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为0.49%。与siRNA对照组相比，转染siRNA-70组的0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量下降了 96. 7%。图11为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-165到细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图。其中左图通过荧光显微镜观察到0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量远比没有 siRNA-165 而仅转染 pEGFP_0RF095 组少。图12为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-165到细胞48小时后的表达情况流式细胞仪检测图。由图可见，流式细胞仪检测到绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为5. 02%。与siRNA对照组相比，转染siRNA-165组的0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量下降了 66. 0%。图13为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-296到细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图。其中左图通过荧光显微镜观察到0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量远比没有 siRNA-296 而仅转染 pEGFP_0RF095 组少。图14为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-296到细胞48小时后的表达情况流式细胞仪检测图。右图可见，流式细胞仪检测到绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为4. 54%。与siRNA对照组相比，转染siRNA-296组的0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量下降了 69. 32%。图15为未转染的细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图。由图可见，通过荧光显微镜观察没有荧光。图16为未转染的细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图，由图可见，流式细胞仪检测到绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为O. 09%，小于1%，说明阴性对照成立。图17为反转录PCR检测siRNA对0RF095基因RNA水平的抑制情况。其中上图和下 图分别为回收细胞提取RNA经反转录后以0RF095为模板和以细胞骨架基因β -actin为内参基因模板跑PCR的后电泳鉴定图。其中M为核酸分子质量标准DL2000，I为转染pEGFP-Nl组，无0RF095被扩增；2为仅转染pEGFP-0RF095组，扩增出的条带最亮；3为siRNA-61抑制pEGFP-0RF095组，相对于对照组可见该组条带较暗，说明siRNA-61对0RF095具有一定的抑制作用；4为siRNA-70抑制pEGFP-0RF095组，相对于对照组可见该组条带最暗，说明siRNA-70对0RF095具有较强的抑制作用；5为siRNA-165抑制pEGFP_0RF095组，相对于对照组可见该组条带较暗，说明siRNA-165对0RF095具有一定的抑制作用；6为siRNA-296抑制pEGFP-0RF095组，相对于对照组可见该组条带较暗，说明siRNA-296对0RF095具有一定的抑制作用；7为对照siRNA抑制pEGFP-0RF095组，相对于对照组可见该组条带变化不明显，说明对照siRNA对0RF095没有抑制作用；8为未转染组，改组DNA为模板没有扩增出目的条带。图18为GTPV感染Vero细胞后细胞发生的病变效应。显微镜观察可看到，Vero细胞出现了纤维化，而且贴壁培养的时候也表现单层生长。GTPV的感染使Veix)细胞产生了非常明显的细胞病变，细胞变圆并从细胞培养板上脱落裂解。图19为转染表达siRNA-61的质粒pGPU6/GFP-0RF095_61后，接种山羊痘病毒的细胞病变效应。显微镜观察可见，山羊痘病毒的感染使VeiO细胞产生了明显的细胞病变，Vero细胞也出现了纤维化，细胞变圆并从细胞培养板上脱落裂解，但是细胞病变效应比仅
接种山羊痘病毒组要轻一些。图20为转染表达siRNA-70的质粒pGPU6/GFP-0RF095_70后，接种山羊痘病毒的细胞病变效应。显微镜观察可见，山羊痘病毒的感染使VeiO细胞产生了少量的细胞病变，Vero细胞也出现了纤维化，细胞变圆并从细胞培养板上脱落裂解，但是细胞病变效应比仅接种山羊痘病毒组要轻很多。图21为转染表达siRNA-165的质粒pGPU6/GFP-0RF095_165后，接种山羊痘病毒的细胞病变效应。显微镜观察可见，山羊痘病毒的感染使VeiO细胞产生了明显的细胞病变，Vero细胞也出现了纤维化，细胞变圆并从细胞培养板上脱落裂解，但是细胞病变效应比仅接种山羊痘病毒组要轻一些。图22为转染表达siRNA-296的质粒pGPU6/GFP-0RF095_296后，接种山羊痘病毒的细胞病变效应。显微镜观察可见，山羊痘病毒的感染使VeiO细胞产生了明显的细胞病变，Vero细胞也出现了纤维化，细胞变圆并从细胞培养板上脱落裂解，但是细胞病变效应比仅接种山羊痘病毒组也轻一些。
图23为转染表达对照siRNA的质粒pGPU6/GFP_0RF095- C后，接种山羊痘病毒的细胞病变效应。显微镜观察可见，山羊痘病毒的感染使VeiO细胞产生了非常明显的细胞病变，Vero细胞也出现了严重的纤维化，细胞变圆并从细胞培养板上脱落裂解，但是细胞病变效应比仅接种山羊痘病毒组相比差不多。图24为未接种山羊痘病毒的细胞。显微镜观察可见Veix)细胞没有产生了细胞病变，也没有出现了纤维化只是形成了复层生长。图25为了证实所观察到的抑制效应，在病毒感染后的不同时间点采集了细胞培养液，并测定病毒毒检测结果。其中I为为转染表达对照siRNA的质粒pGPU6/GFP-0RF095-C后山羊痘病毒感染Vero细胞后病毒滴度达到131825. 7 ;2为转染表达siRNA-61的质粒pGPU6/GFP-0RF095-61后，接种山羊痘病毒72小时后的病毒滴度，与对照组相比，细胞的病毒滴度降低了 23. 4倍；3为转染表达siRNA-70的质粒pGPU6/GFP-0RF095_70后，接种山羊痘病毒比仅接种山羊痘病毒的细胞的病毒滴度降低了 471. 3倍；3为转染表达siRNA-165的质粒pGPU6/GFP-0RF095-165后，接种山羊痘病毒72小时后的病毒滴度，比仅 接种山羊痘病毒的细胞的病毒滴度降低了 I. 9倍；4为转染表达siRNA-296的质粒pGPU6/GFP-0RF095-296后，接种山羊痘病毒比仅接种山羊痘病毒的细胞的病毒滴度降低了 3.8倍。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明进行详细解说.
I.序列的制备
本发明设计的四个序列分别为siRNA-61的基因序列为SEQ. NO. I ； siRNA-70的基因序列为SEQ. NO. 2 ；siRNA-165的基因序列为SEQ. NO. 3 ；siRNA-296的基因序列为SEQ. NO. 4。将设计好的序列发送至上海吉玛制药技术有限公司进行5’端修饰合成。2. pEGFP-0RF095表达载体的构建
使用TaKaRa公司DNA提取试剂盒从细胞毒株中提取DNA，以提取纯化的病毒DNA为模板进行扩增，PCR 反应体系为IOXPCR Buffer (含 Mg2+) 5 μ L，dNTPs 4 μ L，模板 I μ L，引物F、P各lyL，rTaq酶O. 5 yL，补超纯水至50 μ L0反应条件为95° C 5 min;94° C 30 s，55° C 30 s’ 72° C 30 s’ 30 个循环；72° C 10 min。经反应获得的目的基因用胶回收试剂盒回收后，直接连入PM D18-T simple载体并转化DH5a大肠杆菌。经蓝白斑筛选挑选白斑，小量制备质粒，以Xhol和BamHI酶切和PCR方法鉴定阳性克隆并送大连宝生物公司测序。用Xhol、BamHI对阳性pMD18_T simple质粒进行双酶切，回收目的片段。用T4DNA连接酶连接到经Xhol、BamHI双酶切、纯化、回收的pEGFP-Nl大片段上并转化入DH5a大肠杆菌中，涂布于含有50 μ L/mL卡那霉素的LB培养基平板，置于37°C培养箱过夜培养，经蓝白斑筛选挑选白斑，小量制备质粒，以Xhol和BamHI酶切和测序方法鉴定所构建表达质粒PEGFP-0RF095序列完全正确且读码框无错误。3. pEGFP-0RF095 和 4 个 siRNA 分别共转染 BHK21 细胞
将鉴定好的PEGFP-0RF095菌落转入IOOml大瓶培养，进行中量质粒提取(按说明操作)，再次经酶切消化鉴定后测OD值，计算出浓度，备转染用。按常规方法，将细胞以每孔0.5X105个接种于24孔板，待单层细胞生长至80% 90% 后，每孔按优化好的质粒 DNA:FuGENE HD Transfection Regent=O. 8 μ g : 3 μ I的比例进行转染，设未转染的细胞为空白对照。转染的细胞分别培养24、48和72 h后，在荧光显微镜下直接检测EGFP的表达。4.不同方法检测4个siRNA对0RF095的干扰效果
4.I荧光显微镜初步观察4个siRNA对0RF095的抑制效果
Olympus荧光倒置显微镜观察荧光表达情况。并随机选择视野拍照。结果可见图1，3，5，7，9，11，13，15。由图1，3，5，7，9，11，13，15(已修改)看出，跟对照相比，共转染4个siRNA和pEGFP-0RF095的组荧光均明显少于对照组。说明4个siRNA能够抑制0RF095的表达。4. 2流式细胞仪检测干扰效果
将转染后48h的细胞弃培养液，PBS液冲洗，用O. 25%胰酶消化收集细胞，4°C 4000rpm离心5min，弃上清，加入PBS液，用吸管反复吹打混匀细胞，室温置30min。流式细胞仪检测 绿色荧光蛋白强度，由软件分析出细胞荧光阳性率。未做任何转染的细胞作为对照。结果见图 2,4,6,8,10，12，14，16。4. 3 RT-PCR检测干扰效果
将共转染后48 h的细胞提取总RNA反转录，半定量PCR检测0RF095蛋白mRNA水平，并以β-actin基因作为内参。PCR产物分别取等量经10 g · I/1的琼脂糖凝胶电泳分离。并在Labworks分析系统上进行图象处理及灰度分析。结果见图17，与阴性对照组相比，4个siRNA对0RF095蛋白均有一定抑制作用。5表达siRNA的质粒构建
采用上海吉玛制药技术有限公司的短发卡RNA质粒载体pGPU6/GFP/Neo为骨架，设计出能够表达出 siRNA-61，siRNA-70，siRNA-165 和 siRNA-296 的 pGPU6/GFP-0RF095_61，PGPU6/GFP-0RF095-70, pGPU6/GFP-0RF095-165,
PGPU6/GFP-0RF095-296 和对照 pGPU6/GFP-0RF095_C，经电泳和测序鉴定正确。6 表达靶向 0RF095 的 siRNA-61、siRNA-70、siRNA_l siRNA-65 和 siRNA-296 质粒载体体外抑制山羊痘病毒
在培养过程中，于不同时间点通过倒置显微镜观察细胞的抗病毒感染能力，在病毒感染之后的不同时间点对细胞培养液采样，并测定病毒效价。山羊痘病毒毒株毒价测定前，须在Vero细胞上传代培养3飞代，使得病毒适应特定的细胞株。病毒毒价测定操作程序如下
(I)将Vero细胞在96孔板上进行培养长满孔底。(2)用不含血清和不含抗生素DMEM培养液对原始病毒进行十倍系列稀释。(3)弃掉培养液，每孔加IPL某一稀释度的病毒液，一个稀释度3个重复孔。加好培养液后，将细胞置于37°C、5%C02培养箱培养。(4)培养120小时后，倒置显微镜下观察并记录每个稀释度细胞出现CPE的细胞孔数，采用Reed-Muenoh公式，计算得出病毒的半数细胞感染剂量(TCID5tl)。由于山羊痘病毒感染周期较长，故选择在预先感染山羊痘病毒之后，再转化pGPU6/GFP-shRNA质粒。应用病毒感染前24小时将细胞置于12孔板。加入I mL适当的完全培养基孵育过夜。在转染当天细胞应该达到约50%密度。转染GTPV方法同前，36小时之后，按常规方法，待单层细胞生长至80°/Γ90%后，每孔按优化好的质粒DNA = FuGENE HDTransfection Regent=O. 8 μ g:3PL的比例进行转染,设未转染的细胞为空白对照。6小时之后，弃去培养基，加入3%FBS的DMEM，于37°C 5 % CO2培养箱内孵育细胞。在培养过程中，在不同时间点于倒置显微镜下观察细胞的抗病毒感染情况，在病毒感染之后的不同时间点对细胞培养液取样，测定病毒的毒价。同样，我们将pGPU6/GFP-0RF095-61，70，165和296对Vero细胞进行了瞬时转染，并在转染之后36小时按常规方法接种山羊痘病毒，之后在显微镜下观察细胞病变，结果见图 17，18，19，20，21，22，23，24，即与对照组 pGPU6/GFP_0RF095_C 相比，pGPU6/GFP-0RF095-61，70，165和296转染组细胞病变均减弱；再在不同时间点取培养液进行病毒毒价检测，结果见图25，发现与对照组pGPU6/GFP-0RF095-C相比，pGPU6/GFP-0RF095_61，70，165和296转染组的山羊痘病毒滴度均下降。通过上述方法,可证明本发明所设计合成的4个siRNA序列siRNA-61, siRNA-70 siRNA- 165和siRNA-296对0RF095蛋白具有明显的抑制作用，并且对山羊痘病毒具有一定的抑制作用。
权利要求
1. 一个靶向抑制羊痘病毒0RF095基因的序列siRNA-296，其特征在于siRNA_296的基因序列为SEQ. NO. 4。
全文摘要
本发明公开一个可抑制羊痘病毒的siRNA-296序列，这个序列为gccatgatgaactagtaaaagttcaagagacttttactagttcatcatggctt。相关的实验提示本发明的这一序列可以抑制羊痘病毒P32基因的表达，可在制备抗羊痘病毒的疫苗中的应用，也可在制备抗羊痘病毒的药物中的应用，更进一步讲，本发明的序列可在培育具有抗羊痘病毒的羊品种中应用。
文档编号C12N15/113GK102827842SQ20121031483
公开日2012年12月19日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者张强, 赵志荀, 吴国华, 颜新敏, 李健, 朱海霞, 崔立凡, 高顺平, 才学鹏 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所