专利名称：一种海水中重金属镉污染的生物学灵敏检测方法
技术领域：
本发明属于海洋污染的生物探针监测领域，涉及水生动物分子生物学技术，具体的说是一种新型、高效、灵敏的海水重金属镉的生物学检测方法。
背景技术：
近年来，随着我国采矿、冶炼、陶瓷、电镀、颜料及电子工业的迅猛发展，使镉、砷、汞等有害重金属以工业“三废”形式大量排放到自然界，不仅对耕地等土壤环境造成污染，还会随水体的地表及地下径流进入海洋，对近岸水体造成严重污染。其中，我国环渤海区域 近岸海域水体重金属镉(Cd2+)的污染尤为严重。重金属镉的污染不仅具有范围广，持续时间长，不易在生物体内分解排放和污染后难以发现等特点，且可沿食物链转移进而在人体内富集，对人类健康造成严重危害。因此，重金属镉的污染已经成为全社会普遍关注的热点问题，也是国内外学者面临的重要研究命题之一。镉(Cd)原子量112. 41，在周期表中属II B族元素。镉溶于酸但不溶于碱，其氧化态为Cd + 1和Cd + 2。镉可形成多种配离子，如Cd(NH3)' Cd(CN)、CdCl等。镉对动植物毒性较大，被其污染的空气和食物对人体危害严重。早在上世纪中期，日本富山县神通川流域河岸出现的“痛痛病”，即患者出现腰、背、手、脚等关节有针刺般痛感，数年后骨骼严重畸形，骨脆易折，其原因是该河岸的冶炼厂等排放的含镉物质污染了水体，当地居民长期饮用镉污染的河水并食用镉污染水种植的稻米，使镉在体内蓄积而中毒致病。2011年2月，国内许多媒体报道，我国一些矿区残留的重金属镉正通过污染土壤侵入稻米，抽样调查显示中国多地市场上约10%大米镉含量超过国家规定的标准，引起了食品卫生部门的高度重视。许多研究证明，镉对植物体产生毒性的临界值一般高于动物和人体毒害临界值，也就是说，重金属镉对动物及人体的危害比植物更为严重。许多研究表明，各种海洋动物由于生境和食性的差别，其体内重金属蓄积的种类有所不同。例如以浮游生物为食的鱼类、贝类等体内的砷、镉的含量较高，以固着藻类和有机质碎屑为食的鱼类和贝类等体内铬、铜的含量较高，以底栖小型动物为食的鱼类和贝类体内锌的含量较高，杂食性动物体内的铅、镍含量高。以上为本发明生物材料的选择提供了基础。目前，世界各国都十分重视重金属镉污染的环境检测，不断加强对采矿废料、工业废水、生活污水的监测和处理，对于农产品和水产品中的有害物也有严格的卫生检测标准、检测机构和定期监测部门。但是，传统的几种检测手段在灵敏度和稳定性方面有明显不足，最重要的是传统方法没有真正反映出生物体在镉胁迫下其生理、生化反应及代谢调节作用等方面的变化。本发明是基于重金属镉对软体动物青蛤产生毒害情况下，引起青蛤相关基因应激表达而建立的一种快速、灵敏的水体重金属镉的有效监测方法，也可以作为环境监测部门评价水体重金属镉对生物产生毒害的早期观测值。热休克蛋白HSP70是一种在几乎所有生物应激细胞中都存在、并广泛参与各种保护机体和细胞功能的大分子，其具有稳定新生多肽、帮助蛋白进入内质网和线粒体等重要作用。该蛋白的基因在重金属胁迫下会大量诱导，以表达出应激性蛋白使机体抵御不良环境。鉴于以上特征，该家族蛋白被认为是水体环境环境监测的重要标志物。使用生物标志物作为监测手段的优点如下；首先，它反映的是生物实际的生理状态，监测的是个体免疫应激反应的相关指标变化，这种变化通常要早于有害物在水体中蓄积水平的变化，因而能起到早期预测的作用，这也是生物标志物最重要之处。另外，目前国内水体重金属生物标志物方面的技术仅局限于测量应激蛋白含量及活性。有关利用应激性蛋白基因的表达过程作为重金属镉污染监测方法方面，没有任何正式的相关技术报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有监测技术中利用传统仪器和生化方法测量的缺点与不足，提供一种快速、灵敏的水体重金属镉的高效分子生物学监测方法。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下
一种监测海水中重金属镉的热休克蛋白HSP-70荧光PCR反应的特异性引物，其特征在
于
扩增引物
上游引物为HSP-70-RT-F :5’-CTGCTTACTTCAACGACTCCC-3’ ；
下游引物为 HSP-70-RT-R :5’ -CTTTTTGTCAAGACCATAGGC-3’ ；
作为内参基因的青蛤β-actin基因特异性上下游引物 β -actin-S :5，-CACCACA ACTGCCGAGAG-3，； β -actin-A :5’-CCGATAGTGATGA CCTGACC-3’。2.本发明所述的特异性引物检测海水中重金属镉污染的生物学方法，其特征在于按如下的步骤进行
(O以青蛤作为用于重金属镉污染监测的指示生物样品；
(2)样品总RNA提取与纯化采用通用的RNA提取方法和纯化方法，从青蛤肝脏提取得到纯化的肝脏总RNA ；
(3)cDNA第一链合成以青蛤肝脏中总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为25 μ L ；
(4)实时荧光PCR检测以上述合成的cDNA第一链为模板，根据所述的特异性引物和内参引物，进行实时荧光PCR扩增反应，获取各管Ct值；
实时荧光PCR扩增体系设置如下
权利要求
1.一种用于监测海水中重金属镉污染的热休克蛋白HSP-70实时荧光定量PCR反应的特异性引物，其特征在于 上游引物为HSP-70-RT-F :5’-CTGCTTACTTCAACGACTCCC-3’ ； 下游引物为HSP-70-RT-R :5’-CTTTTTGTCAAGACCATAGGC-3’ ； 作为内参基因的青蛤β-actin基因特异性上下游引物为 β -actin-S :5，-CACCACAACTGCCGAGAG-3，； β -actin-A :5’-CCGATAGTGATGACCTGACC-3’。
2.一种采用权利要求I所述特异性PCR引物检测海水中重金属镉的生物学方法，其特征在于按如下步骤进行； (O以青蛤作为用于重金属镉污染监测的指示生物样本； (2)样本总RNA提取与纯化采用通用的RNA提取方法和纯化方法，从青蛤肝脏提取得到纯化的肝脏总RNA ； (3)cDNA第一链合成以青蛤肝脏中总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为.25 μ L ； (4)实时荧光PCR检测以上述合成的cDNA第一链为模板，根据所述的特异性引物和内参引物，进行实时荧光PCR扩增反应，获取各管Ct值(Cycle threshold指每个反应管内的荧光信号达到设定阈值所经历的循环数); 实时荧光PCR扩增体系设置如下mTI使用量I终浓度 SYBR PremixDimerEraser (2X )荧光 PCR 混合物_12. 5μ I_>< _ PCRForwardPrimer (10 μ Μ)正向引物O. 75 μ IO. 3 μ MX I PCRReversePrimer (ΙΟμΜ)反向引物0·75μ1O. 3 μ MX I Template (< IOOng)模板2μ1Χ2dH20灭菌蒸馏水_9μ I__ Total Volume 总体积25 μ IX 3 实时定量荧光PCR扩增参数设置如下； Hold (初期变性)=Cycle (循环数)1.95 °C 30 秒 . 3Step PCR (扩增)=Cycle (循环数)40 .95 0C 5 秒 . 55 0C 30 秒 .72 0C 30 秒 Dissociation ； (5)青蛤肝脏HSP70基因的相对表达量计算实时荧光PCR完成后，根据仪器自动记录的每管Ct值，使用以下公式计算； HSP70基因相对表达量=2_ΛΛα ；Δ Ct=Ct HSP70-Ct β -actin ； ΔΔ Ct=(CtHSP70-Ct β -actin)实验组-(CtHSP70_ Ct β -actin)对照组； . 2-δδ 计算实验组模板中Hsp70基因的量相对于对照组的变化量，取实验均值，即为青蛤肝脏HSP70基因的相对表达量。
全文摘要
本发明公开了一种高效、简捷、灵敏检测海水中重金属镉的生物学方法。具体是将青蛤分别置于含有重金属镉(Cd2+)和不含镉(Cd2+)的海水中，在96h后解剖获取青蛤肝脏组织，提取其总RNA并反转录为cDNA，根据设计的特异性引物，利用实时荧光定量PCR方法测定实验组青蛤HSP70(热休克蛋白70)基因的表达量与对照组的差别，水体中的重金属镉(Cd2+)含量越高则热休克蛋白基因的相对表达量越大，并且可以观察到分析仪器难以检测出的水体中低浓度镉(Cd2+)。本发明能够作为一种常规生物技术监测海水中重金属镉的污染程度及不同水域间的差异，它具有分析灵敏度高、对比性强等特点，可以评价重金属镉(Cd2+)对水域及生物体的有害风险，避免势态严重而造成不可挽回的损失。
文档编号C12N15/11GK102808036SQ201210316610
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者潘宝平, 张丽岩, 罗凯娅 申请人:天津师范大学