专利名称：一种检测大口黑鲈虹彩病毒的双重pcr方法
技术领域：
本发明涉及PCR技术领域，特别涉及ー种检测大ロ黑鲈虹彩病毒的双重PCR技木。
背景技术：
大口黑S卢(Micropterus salmoides,或 Largemouth bass),俗称加州S卢，原产于北美密西西比河流域，属广温性鱼类，具有生长快、病害少、耐低温、肉质鲜美和容易捕捞等特点，已成为我国重要的淡水养殖品种。从20世纪90年代开始，我国池塘养殖大口黑鲈发生病害的问题越来越复杂，如烂鳃病、肠炎病、腐皮病、水霉病、车轮虫病、杯体虫病等，导致大ロ黑鲈发病的病原主要是嗜水气单胞菌，柱状黄杆菌，霉菌和寄生虫，确诊由病毒感染导致发病的报道较少。大口黑鲈虹彩病毒(LMBV，又称SCRV)通常指的是虹彩病毒科(Iridoviridae)的娃病毒属(ZfeflaFirw1S),最早分离自1991年美国佛罗里达州Lake Weir市的野生大口黑鲈。1995年美国南卡罗莱纳州的Santee-Cooper水库养殖的大口黑鲈暴 发鱼灾(fish kill)引起人们高度关注。该病毒的特点是不仅可以导致大面积鱼爆发疾病死亡引起鱼灾，也可以是不表现任何症状的隐性带毒，因此对大口黑鲈健康养殖带来巨大威胁。2009年邓国成等人报道了大口黑鲈溃疡病是由虹彩病毒感染引起的，这是国内对大ロ黑鲈溃疡病毒性病原的首次报道。而虹彩病毒科中另外ー个重要的病毒属肿大细胞病毒属(Megalocytivirus')，对鱼的致病性更强，该类病毒引起的鱼类疾病呈逐年上升趋势，患病鱼死亡率达30-100%。马冬梅等人研究证实大口黑鲈的肝脾肿大症由肿大细胞病毒属虹彩病毒引起，实验室大ロ黑鲈攻毒试验显示100%死亡率(马冬梅等，大ロ黑鲈肝脾肿大病病原研究，中国水产科学，2011, 18 (3), 654-659)ο两种不同种属虹彩病毒对大ロ黑S卢养埴的影响，引起广大科研人员和基层养殖户对该类病原的高度关注。在虹彩病毒中，研究比较清楚的结构蛋白是主衣壳蛋白(MCP)。MCP占整个病毒粒子多肽的40-45%，是虹彩病毒粒子中丰度最高的蛋白，并且在虹彩病毒科中高度保守，因此可以利用MCP的同源性差异进行虹彩病毒分子进化方面的研究。1999年Mao J等人综合大口黑鲈病毒蛋白合成分析，限制性片段长度多态分析(RFLP)，MCP和DNA甲基转移酶(DMet)基因序列分析的結果，明确了大口黑鲈虹彩病毒的分类地位为虹彩病毒科蛙病毒属成员。Mao J等人比较了 LMBV与蛙病毒3 (FV3)等的MCP和DMet基因的氨基酸序列，以及它们的限制性内切酶图谱，结果显示LMBV与蛙病毒代表株FV3有一定差距。在国际病毒分类委员会第八次报告中将LMBV归类为娃病毒属的Santee-Cooper ranavirus种。目前,针对大ロ黑鲈蛙病毒属的常规PCR和荧光定量PCR检测方法虽然已有报道，但尚缺乏ー种能快速、准确地同时对大口黑鲈蛙病毒属和肿大细胞病毒属两种虹彩病毒进行检测的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可同时检测、鉴别蛙病毒属和肿大细胞病毒属两种虹彩病毒的双重PCR检测方法。本发明所采取的技术方案是一种检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，包括以下步骤
O从待检大口黑鲈的组织器官提取基因组DNA ；
2)以基因组DNA为模板，使用分别根据大口黑鲈虹彩病毒科蛙病毒属和肿大细胞病毒属的MCP基因序列设计合成的两对引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；其中引物序列如下
娃病毒属引物Ranancp
上游引物tatgtgctcaactcttggctggtc (SEQ ID NO. I),
下游引物ccacgatgggcttgacttctcc (SEQ ID NO. 2)；
肿大细胞病毒属Megancp 上游引物atgctcattgaacagtgccaggtg (SEQ ID NO. 3),
下游引物ggtggagccgaggggtgttc (SEQ ID NO. 4)；
3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，然后根据电泳结果进行判定，其中蛙病毒扩增产物长475bp，肿大细胞病毒扩增产物长262bp。所述双重PCR反应体系为待检DNA t旲板或阳性质控品或阴性质控品2 μ I，IOXbuffer 5 μ I, MgCl2 浓度 I. 5mmol/L,各引物浓度 O. 5 μ mol/L, dNTP 浓度 O. 4mmol/L,Taq 酶 2. 5U, ddH20 补齐至 50 μ I ；
所述双重 PCR 反应条件为95°C 5min ；94°C 30s，55_58°C 30s, 72°C 30s，反应 30-35次循环；72°C IOmin ；
优选的，退火温度为55°C ；
优选的，反应循环数为30次。ー种大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR检测试剂盒，包括如下成分10XPCR buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、引物、阳性质控品、阴性质控品，其特征在于，所用引物序列分别为
娃病毒属引物Ranancp
上游引物tatgtgctcaactcttggctggtc (SEQ ID NO. I),
下游引物ccacgatgggcttgacttctcc (SEQ ID NO. 2)；
肿大细胞病毒属Megancp
上游引物atgctcattgaacagtgccaggtg (SEQ ID NO. 3),
下游引物ggtggagccgaggggtgttc (SEQ ID NO. 4)；
所述阳性质控品为SD-R和NH-M的DNA模板，阴性质控品为无菌ddH20。本发明的有益效果是
本发明可同时检测蛙病毒属和肿大细胞病毒属两种虹彩病毒，该发明方法敏感性強、特异性高，可以快速、准确地对大口黑鲈虹彩病毒进行诊断和种属鉴定。
图I为特异性试验电泳图谱；
图2为敏感性试验电泳图谱；
图3为病料检测试验电泳图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施案例进ー步描述本发明。引物的设计根据GenBank中LMBV的MCP基因序列(登录号⑶256635)和马冬梅等发表的大口黑鲈肝脾肿大症病毒的MCP基因序列，设计和筛选出两对特异性片段引物。各引物序列和预期扩增片段长度如下
权利要求
1.一种检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，包括以下步骤 1)从待检大口黑鲈的组织器官提取基因组DNA; 2)以基因组DNA为模板，使用分别根据大ロ黑鲈虹彩病毒科蛙病毒属和肿大细胞病毒属的MCP基因序列设计合成的两对引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；其中引物序列如下 娃病毒属引物Ranancp 上游引物tatgtgctcaactcttggctggtc (SEQ ID NO. I), 下游引物ccacgatgggcttgacttctcc (SEQ ID NO. 2)； 肿大细胞病毒属Megancp 上游引物atgctcattgaacagtgccaggtg (SEQ ID NO. 3), 下游引物ggtggagccgaggggtgttc (SEQ ID NO. 4)； 3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，然后根据电泳结果进行判定，其中蛙病毒扩增产物长475bp，肿大细胞病毒扩增产物长262bp。
2.根据权利要求I所述的检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，其特征在于所述双重PCR反应体系为待检DNA模板或阳性质控品或阴性质控品2 yl，IOXbuffer 5u I,MgCl2 浓度 I. 5mmol/L，各引物浓度 0. 5 u mol/L, dNTP 浓度 0. 4mmol/L, Taq 酶 2. 5U, ddH20补齐至50 u I0
3.根据权利要求I所述的检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，其特征在于所述双 重 PCR 反应条件为95°C 5min ；94°C 30s，55_58°C 30s, 72°C 30s，反应 30-35 次循环；72°C IOmin。
4.根据权利要求3所述的检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，其特征在于退火温度为55で。
5.根据权利要求3所述的检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，其特征在于反应循环数为30次。
6.ー种大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR检测试剂盒，包括如下成分10XPCR buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、引物、阳性质控品、阴性质控品，其特征在于，所用引物序列分别为 娃病毒属引物Ranancp 上游引物tatgtgctcaactcttggctggtc (SEQ ID NO. I), 下游引物ccacgatgggcttgacttctcc (SEQ ID NO. 2)； 肿大细胞病毒属Megancp 上游引物atgctcattgaacagtgccaggtg (SEQ ID NO. 3), 下游引物ggtggagccgaggggtgttc (SEQ ID NO. 4)。
7.根据权利要求6所述的ー种大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR检测试剂盒，其特征在于所述阳性质控品为SD-R和NH-M的DNA模板，阴性质控品为无菌ddH20。
全文摘要
本发明公开了一种检测大口黑鲈虹彩病毒的双重PCR方法，通过设计的两对特异性引物和优选的反应体系、反应条件，可同时检测、鉴别蛙病毒属和肿大细胞病毒属两种虹彩病毒，该发明方法敏感性强、特异性高，可以快速、准确地对大口黑鲈虹彩病毒进行诊断和种属鉴定。
文档编号C12Q1/68GK102816868SQ201210316708
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者王庆, 曾伟伟, 刘春 , 李凯彬, 王芳, 王英英, 石存斌, 吴淑勤 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所