专利名称：一种芹菜为原料制作适宜恶疫霉菌产生孢子囊的液体培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物保护领域中ー种植物病原菌恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)产孢子囊的液体培养基。
背景技术：
恶疫霉(Phytophthora cactorum Schroet),属卵菌门疫霉属病原菌,是全世界范围内广泛分布的重要植物病原菌，能侵染约60个科、50个属中的约200种植物。恶疫霉菌通常以菌丝体和卵孢子在病残体和土壌中越冬。翌年条件适宜时菌丝直接侵染寄主，或形成大量游动孢子囊传播到地上部侵染茎叶。孢子囊在该病的传播和蔓延中起着非常重要的作用。通常，在室内进行致病力測定或其它相关生物学特性研究时均需要制备孢子囊悬浮 液。目前，诱导恶疫霉产生孢子囊的方法主要采用菌丝水培法，主要方式有(I)将培养好的菌丝体置于装有消毒土壌浸出液或灭菌蒸馏水的皮氏培养液中，再将培养皿置于荧光灯下照射3天，每天振荡皿液3次，第三次补充液体，并在8°C下培养2小时使游动孢子释放。(2)从菌落边缘切取菌丝块放入15ml 10% V6培养液的培养皿中，置于25°C、黑暗中培养3d，然后将菌丝挑入倒有15ml灭菌蒸馏水的培养皿内，置于25°C下光照3d，每天换水I次。孢子囊产生后将盛有大量孢子囊的培养皿放入4°C冰箱中15min后，移至25°C下静置20min，诱使大量游动孢子产生。各种水培法在实施过程中所用试验材料繁多，试验步骤较多，操作复杂，且在有些供试液体培养基中产生的孢子囊不容易释放出游动孢子，影响下ー步试验的开展。因此，迫切需要一种筛选出ー种原料简单、操作简便的培养基，使恶疫霉能在该液体培养基中产生大量孢子囊且易释放出游动孢子用于相关研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种使恶疫霉菌产生孢子囊的液体培养基。本发明克服了目前利用恶疫霉菌菌丝水培法诱导产生孢子囊原料繁多、操作复杂的缺点，提供了一种简便易行的在液体培养基中培养产生孢子囊的方法。本发明的技术方案是利用；^:菜(Apium graveolens)为原料制作液体培养基用于
恶疫霉产生孢子囊。以芹菜为原料制作适宜恶疫霉菌产生孢子囊的液体培养基，具体制作方法为，芹菜去叶洗浄切碎后按w/ν为I : I的比例加入去离子水于榨汁机中榨汁，将所得芹菜汁用四层纱布过滤后用含0.02% (w/v)CaCO3去离子水稀释至含芹菜汁10% 50% (v/v)，分装后以0. 103MPa、121°C、高压蒸气灭菌20min ;将灭菌液体培养基倒入灭菌的9cm直径培养皿中，每皿倒15ml。培养液冷却后用直径5mm的打孔器在已培养3d的菌落边缘打取菌块接种于液体培养基中，每皿放入5个菌丝块。将接种后的培养皿置于25°C下黑暗培养5d后，将液体培养基倒棹，用无菌水继续培养2d后，更换一次无菌水，再培养3d后便产生大量孢子嚢。随后将培养皿置于4°C冰箱中处理30-60min，再置于25°C下培养l_2h，孢子囊开始大量释放出游动孢子。本发明的有益效果是利用芹菜ー种原料制作的液体培养基就能产生大量孢子囊，克服了以往采用2种或多种蔬菜不同比例混合才能获取大量孢子囊的繁杂操作。另外，该培养基原材料成本低廉且容易获取，培养基的制作和孢子囊产生的程序简单易学，且这种方法可以用于孢子囊形态的鉴定、恶疫霉菌致病力測定中游动孢子悬浮液的制备等相关的研究，具有较高的实际应用价值。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例芹菜液体培养基与其它液体培养基产孢子囊能力及游动孢子释放能力差异比较
I、液体培养基制作(I)黄瓜培养基(10% ):黄瓜洗净切碎后于榨汁机中榨汁，所得汁液用四层纱布过滤后与含O. 02% CaCO3去离子水按体积比I : 9比例混匀。(2)黄瓜培养基(50% ):黄瓜洗净切碎后于榨汁机中榨汁，所得汁液用四层纱布过滤后与含O. 02% CaCO3去离子水按体积比I : I比例混匀。(3)番茄培养基(10% ):番茄洗净切碎后于榨汁机中榨汁，所得汁液用四层纱布过滤后与含O. 02% CaCO3去离子水按体积比I : 9比例混匀。(4)番茄培养基(50% ):番茄洗净切碎后于榨汁机中榨汁，所得汁液用四层纱布过滤后与含O. 02% CaCO3去离子水按体积比I : I比例混匀。(5)芹菜培养基(10% ):芹菜洗净切碎后于榨汁机中榨汁，所得汁液用四层纱布过滤后与含O. 02% CaCO3去离子水按体积比I : 9比例混匀。(6)芹菜培养基(25% ):芹菜洗净切碎后于榨汁机中榨汁，所得汁液用四层纱布过滤后与含O. 02% CaCO3去离子水按体积比I : 3比例混匀。(7)芹菜培养基(50% ):芹菜洗净切碎后于榨汁机中榨汁，所得汁液用四层纱布过滤后与含O. 02% CaCO3去离子水按体积比I : I比例混匀。(8)番茄黄瓜培养基(10% ):将番茄和黄瓜洗净切碎后于榨汁机中榨汁，所得汁液用四层纱布过滤，按番茄与黄瓜体积比I : 2的比例混合，再将混合液用含O. 02% CaOT3去离子水稀释至10%。(9)番茄黄瓜培养基(50% ):将番茄和黄瓜洗净切碎后于榨汁机中榨汁，所得汁液用四层纱布过滤，按番茄与黄瓜体积比I : 2的比例混合，再将混合液用含O. 02% CaOT3去离子水稀释至50%。(10)番茄芹菜培养基(10% ):将番茄和芹菜洗净切碎后于榨汁机中榨汁，所得汁液用四层纱布过滤，按番茄与芹菜体积比I : 2的比例混合，再将混合液用含O. 02%CaCO3去离子水稀释至10%。(11)番茄芹菜培养基(50% ):将番茄和芹菜洗净切碎后于榨汁机中榨汁，所得汁液用四层纱布过滤，按番茄与芹菜体积比I : 2的比例混合，再将混合液用含O. 02%CaCO3去尚子水稀释至50%。将上述培养基分别分装后于O. 103MPa, 121 °C，高压蒸气灭菌20min。冷却至40°C左右制作液体培养基。2、不同培养基产孢能力差异测定用直径5mm的打孔器在已培养3d的菌落边缘打取菌块，置于上述11种不同液体培养基中，每皿放入5个菌丝块。将接种后的培养皿置于25°C下黑暗培养5d，将液体培养基倒棹，用无菌水继续培养2d后，更换一次无菌水，再培养3d后调查液体培养基中孢子囊产生量。每个培养基重复3次。每次调查从培养皿中用五点法取五块Icm2大小的菌丝块，显微镜10倍目镜下计数每个视野菌丝块上产生的孢子囊数量，统计分析不同液体培养基产生孢子囊能力的差异。待不同液体培养基中恶疫霉菌大量产生孢子囊后，将培养皿置于4°C冰箱中30-60min，再取出置于25°C下培养，观察计数不同液体培养基中游动孢子释放的比例，统计分析不同液体培养基中游动孢子释放能力的差异。
恶疫霉菌在芹菜液体培养基中培养产生孢子囊及游动孢子释放的能力明显高于其它供试培养基(表I)。另外，芹菜液体培养基中芹菜汁的浓度不同对产孢量和游动孢子释放量也有影响，芹菜培养基(10% ) >芹菜培养基(25% ) >芹菜培养基(50% )。表I芹菜培养基与其他培养基产孢子囊能力差异比较
供试培养基単位面积产生孢子囊的量(个/视野)I游动孢子释放比例(％)
黄瓜培养基(10% )17 + 7F5276
黄瓜培养基(50%)83±2D12.8'
番茄培养基(10%)88±4D57. 5
番茄培养基(50%)113±19C8.3
芹菜培养基(10%)214±10A92. 3'
芹菜培养基(25%)196±7AB87.9'
芹菜培养基(50% )174 + 5B8^4
番茄黄瓜培养基(10% ) 111 + 7C6ΤΓ8
番茄黄瓜培养基(50% ) 11±3F26. 7
番茄芹菜培养基(10% ) 17 + 2F7 Τ6
番茄芹菜培养基(50% ) 44 + 4EΙΓδ
:0028]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.ー种以芹菜为原料制作适宜恶疫霉菌产生孢子囊的液体培养基，其特征在于，具体制作方法为，芹菜去叶洗净切碎后按w/v为I : I的比例加入去离子水于榨汁机中榨汁，将所得汁液用四层纱布过滤后用含O. 2% (w/v) CaCO3的去离子水稀释至含芹菜汁10% 50% (v/v)，分装后以O. 103MPa、121°C、高压蒸气灭菌20min ;将灭菌培养基倒入灭菌的培养皿中制成液体培养基。
全文摘要
本发明公开了一种以芹菜为原料制作适宜恶疫霉菌产生孢子囊的液体培养基，具体制作方法为，芹菜去叶洗净切碎后按w//v为1∶1的比例加入去离子水于榨汁机中榨汁，将所得芹菜汁用四层纱布过滤后用含0.02％(w/v)CaCO3的去离子水稀释至含芹菜汁10％～50％(v/v)，分装后以0.103MPa、121℃、高压蒸气灭菌20min；将灭菌液体培养基倒入灭菌的9cm直径培养皿中，每皿倒15ml。该培养基原材料成本低廉且容易获取，培养基的制作和孢子囊产生的程序简单易学，大大提高了恶疫霉菌孢子囊产生的效率，为病原菌接种体的制备提供了极大的便利。
文档编号C12R1/645GK102839148SQ201210323198
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者杨敏, 朱书生, 朱贵李, 梅馨月, 何霞红, 李成云, 朱有勇 申请人:云南农业大学